李斯特菌ST87在25°C不同營(yíng)養(yǎng)條件下牛肉和蔬菜汁中的生長(zhǎng)曲線
病原生物的生物膜發(fā)育在某些食源性疾病中起著關(guān)鍵作用。單核細(xì)胞增生李斯特菌，特別是序列87型（ST87），在中國(guó)已被廣泛發(fā)現(xiàn)。本研究旨在監(jiān)測(cè)食物分離的單核細(xì)胞增生李斯特菌株ST87在不同營(yíng)養(yǎng)條件下生物膜形成的動(dòng)態(tài)過(guò)程。結(jié)果表明，該菌株在營(yíng)養(yǎng)豐富和營(yíng)養(yǎng)有限的條件下都能始終表現(xiàn)出較高的活細(xì)胞計(jì)數(shù)。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)，我們發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞增生李斯特菌ST87能夠在各種營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中形成生物膜，包括牛肉汁和蔬菜汁，將水平維持在2 Log10 CFU/cm以上2.值得注意的是，在營(yíng)養(yǎng)有限的條件下，生物膜的形成速度加快，營(yíng)養(yǎng)有限的蔬菜汁下的細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于營(yíng)養(yǎng)豐富的蔬菜汁下的細(xì)胞計(jì)數(shù)。對(duì)細(xì)胞外聚合物物質(zhì)（EPS）組成的分析顯示，生物膜內(nèi)的活細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞外蛋白變異之間存在一致的模式。此外，對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分（蛋白質(zhì)、脂肪、總糖、灰分和pH值）的評(píng)估揭示了細(xì)胞外物質(zhì)與pH值之間的正相關(guān)，但與其他營(yíng)養(yǎng)成分之間存在負(fù)相關(guān)。
將制備的兩種單核細(xì)胞增生李斯特菌株的生物量分別加入到各培養(yǎng)基（TSB-YE、DTSB-YE、BBB、DBBB、VBB和DVBB）中，比例為1：10，使單核細(xì)胞增生李斯特菌密度約為103CFU/毫升。將每組接種的培養(yǎng)液的體積為200μL，一式三份分配到100孔蜂窩®微孔板的孔中。使用Bioscreen C（Oy Growth Curves Ab Ltd.，Helsinki，F(xiàn)inland）在25°C下以中等強(qiáng)度連續(xù)振蕩72小時(shí)，并在600nm波長(zhǎng)（OD 600）OD下測(cè)量光密度600每2小時(shí)測(cè)量一次。將每種無(wú)菌培養(yǎng)物作為對(duì)照納入并用于校正OD600值。該實(shí)驗(yàn)是用兩個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行的，每個(gè)重復(fù)在三個(gè)技術(shù)上平行。
本研究旨在評(píng)估單核細(xì)胞增生李斯特菌株在各種營(yíng)養(yǎng)條件下牛肉和蔬菜汁中的生物膜形成潛力。主要目的是：（1）探索不同濃度下單核細(xì)胞增生李斯特菌ST87生物膜在殘留食品（牛肉汁和蔬菜汁）中的粘附和動(dòng)態(tài)發(fā)育，以及（2）進(jìn)行定量分析并關(guān)聯(lián)該菌株在不同營(yíng)養(yǎng)條件下產(chǎn)生的EPS。
圖1.單核細(xì)胞增生李斯特菌ST87和ATCC 19112在不同溫度下TSB-YE（a，b）和DTSB-YE（c，d）形成的生物膜中的活力
圖2.單核細(xì)胞增生李斯特菌ST87菌株在不同溫度下在牛肉（a，b）和蔬菜汁（c，d）中形成的生物膜中的活力。
圖3.單核細(xì)胞增生李斯特菌ST87在25°C不同營(yíng)養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線。
圖4.測(cè)定在25°C下在不同營(yíng)養(yǎng)條件下形成的生物膜中ST87細(xì)胞外物質(zhì)含量。注：a、d、g代表細(xì)胞外蛋白含量測(cè)定，b、e、h代表細(xì)胞外多糖含量測(cè)定，c、f、i代表細(xì)胞外DNA含量測(cè)定，a-c代表不同濃度TSB-YE下形成的生物膜，d-f代表不同濃度牛湯下形成的生物膜，g-i代表不同濃度蔬菜汁下形成的生物膜。
圖5.25°C時(shí)ST87生物膜中活細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞外蛋白含量的趨勢(shì)。
圖6.25°C下ST87生物膜中的細(xì)胞外物質(zhì)與生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分之間的Spearman相關(guān)系數(shù)熱圖，以及培養(yǎng)時(shí)間。
結(jié)論：本研究表明，分離出的單核細(xì)胞增生李斯特菌ST87菌株具有較強(qiáng)的生物膜形成能力，使得該菌株在食物殘?jiān)峁┑臓I(yíng)養(yǎng)豐富和營(yíng)養(yǎng)有限的環(huán)境中容易形成生物膜，從而對(duì)人類健康和安全構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)。稀釋培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少的存在可能會(huì)對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌造成壓力，導(dǎo)致生物膜形成加速和EPS豐度增加。此外，生物膜細(xì)胞外成分與培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分以及孵育時(shí)間之間的Spearman相關(guān)性分析為識(shí)別促進(jìn)生物膜生長(zhǎng)和減少生物膜形成的特定因素提供了新的見(jiàn)解。
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