微生物生長(zhǎng)曲線監(jiān)測(cè)儀測(cè)定納米銀對(duì)副溶血弧菌的最小抑菌濃度（二）
1.3河口水樣的采集、分析與處理
河口水采樣點(diǎn)信息如表1所示，采集時(shí)間為2022年4月和12月，方法參照Das等的報(bào)道。簡(jiǎn)而言之，使用4 L柱式聚乙烯采水器在水面下10~15 cm處采集，然后裝在潔凈玻璃瓶中于室溫下運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室。為去除自然菌群的干擾，樣品到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后在121℃下滅菌30 min。然后于室溫下密閉保存，使用前搖勻。
1.4EMGA法測(cè)定
如圖1所示，EMGA法測(cè)定Ag NPs在河口水中抑菌效應(yīng)的操作包括2個(gè)步驟：1)副溶血弧菌急性暴露于Ag NPs之后，暴露混合液加入預(yù)裝有LB液體表1采樣點(diǎn)經(jīng)緯度信息培養(yǎng)基的檢測(cè)管中；2)檢測(cè)管置入EMGA中測(cè)定存活細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線，從而示出最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)。
具體如下：將10 8 CFU/mL副溶血弧菌接種到滅菌處理過(guò)的河口水樣品中，使其終濃度為10 5 CFU/mL。然后各取10 mL分裝入6個(gè)15 mL離心管中。分別加入倍比質(zhì)量的Ag NPs，使該納米材料的終濃度分別為0、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0和48.0 mg/L。室溫下，150 r/min輕搖離心管30 min，然后各取200μL暴露作用后的混合液分別注入預(yù)裝有1.8 mL LB液體培養(yǎng)基的檢測(cè)管(外徑5 mm,NORELL公司,美國(guó))中。以滅菌LB液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，同樣裝入檢測(cè)管。將每個(gè)檢測(cè)管分別插入EMGA的一個(gè)工作通道中，開啟儀器，設(shè)置參數(shù)——激勵(lì)電壓12 V、激勵(lì)頻率400 MHz、采集周期1 min和采集次數(shù)1 200，點(diǎn)擊“開始”鍵，EMGA即實(shí)時(shí)呈現(xiàn)所有檢測(cè)管中細(xì)菌生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)(ΔC 4-t)曲線。測(cè)定結(jié)束后，根據(jù)是否出現(xiàn)反正弦型生長(zhǎng)曲線直接讀出生理鹽水中Ag NPs對(duì)副溶血弧菌的MIC值。
圖1 EMGA法測(cè)定河口水樣中Ag NPs對(duì)副溶血弧菌抑制活性的示意圖
1.5BMD法測(cè)定
根據(jù)CLSI規(guī)定的BMD方法測(cè)定河口水中Ag NPs對(duì)副溶血弧菌的抑制效應(yīng)。10 5 CFU/mL副溶血弧菌急性暴露于Ag NPs之后，將混合物裝入離心管中，采用Optima XL-90型離心機(jī)(貝克曼庫(kù)爾特公司,美國(guó))處理5 min(3 000 r/min)以去除影響結(jié)果判斷的懸浮顆粒。然后，各取20μL暴露作用后的混合液分別注入預(yù)裝有180μL LB液體培養(yǎng)基的96孔板(Biosense微生物生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，丹麥)中。用封口膜封住96孔板以防蒸發(fā)。將96孔板放在培養(yǎng)箱中于36℃下培養(yǎng)20 h，取出后，通過(guò)肉眼觀察是否渾濁判斷是否有菌生長(zhǎng)增殖，進(jìn)而讀出MIC值。
1.6平板計(jì)數(shù)法
測(cè)定參照Feng等報(bào)道的平板計(jì)數(shù)法測(cè)定河口水中Ag NPs對(duì)副溶血弧菌的抑制效應(yīng)。10 5 CFU/mL副溶血弧菌急性暴露于Ag NPs之后，如無(wú)特殊說(shuō)明，采用1.5部分述及的離心法除去混合物中的懸浮顆粒。然后，采用移液器各取100μL暴露作用后的混合液，10倍梯度稀釋后，分別均勻涂在LB瓊脂平板上。瓊脂平板加蓋后，在培養(yǎng)箱中于36℃下靜止培養(yǎng)過(guò)夜，取出后，通過(guò)觀察是否有菌斑生成判斷細(xì)菌是否被完全抑制，進(jìn)而判斷出MIC值。
1.7數(shù)據(jù)處理與分析
以BMD法或平板計(jì)數(shù)法所測(cè)定的MIC值為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，采用基本符合(EA)率值考察EMGA法測(cè)定Ag NPs抑菌活性的有效性。即將EMGA法測(cè)定的Ag NPs對(duì)副溶血弧菌的MIC值與平板計(jì)數(shù)法或BMD法所測(cè)定的MIC值比較，如果正負(fù)相差不大于1倍，則視作基本符合(EA)；如果正負(fù)相差大于1倍而不大于2倍，則視作小偏差(mE)；如果正負(fù)相差大于2倍，則視作大偏差(ME)。為了驗(yàn)證EMGA法的重現(xiàn)性和精密度，測(cè)定Ag NPs在河口水樣S1中抑菌效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)做9個(gè)平行。采用Microsoft Excel2021處理數(shù)據(jù)以計(jì)算出平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。
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