利用細(xì)菌生長(zhǎng)曲線表征芳樟醇對(duì)三文魚莓實(shí)假單胞菌MS 02的抑菌效果（二）
2結(jié)果與分析
2.1α多樣性分析結(jié)果
對(duì)單樣本的α多樣性分析可以反映樣本內(nèi)的微生物群落的豐富度和多樣性。由表1可知，5個(gè)樣品的微生物覆蓋率（Coverage）均為1.000，說明該測(cè)序結(jié)果鑒定了三文魚片中絕大多數(shù)細(xì)菌的系統(tǒng)類別。檢測(cè)結(jié)果表明，從0～12 d的樣品觀察到的細(xì)菌OTUs數(shù)量分別為121、104、125、135、128。以Shannon、Simpson、Chao1及Ace指數(shù)對(duì)樣品的菌群豐富度和多樣性進(jìn)行初步評(píng)估。Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)用于估算樣品中微生物的多樣性，Shannon越大，群落多樣性越高，Simpson指數(shù)則相反；而Chao1指數(shù)及Ace指數(shù)常用于估算樣品的菌群豐度，是OTUs豐度的其他估計(jì)量。表中數(shù)據(jù)顯示Shannon指數(shù)逐日增加，而Simpson指數(shù)則相反，說明樣品的微生物多樣性逐漸增多；而Chao1及ACE指數(shù)均高于每個(gè)相應(yīng)樣本的OTUs觀察數(shù)則表明在所有樣品中可能還存在一些額外的微生物門類。
表1不同貯藏時(shí)間三文魚微生物群落的α多樣性指數(shù)
基于OTUs分析制作三文魚樣品的Venn圖，不同的橢圓代表不同組樣品，重疊部分的數(shù)字代表樣本間共有的OTUs個(gè)數(shù)，單獨(dú)的數(shù)字代表樣本特有OTUs個(gè)數(shù)。由圖1可知，整個(gè)貯藏期間三文魚OTUs總數(shù)為210個(gè)，其中5組樣品共有的有56個(gè)，占總數(shù)的26.67%；第0天（S0d）OTUs數(shù)量為121個(gè)，占總數(shù)的57.62%；第3天（S3d）OTUs數(shù)量為104個(gè)，占總數(shù)的49.52%；第6天（S6d）OTUs數(shù)量為125個(gè)，占總數(shù)的59.52%；第9天（S9d）OTUs數(shù)量為135個(gè)，占總數(shù)的64.29%；第12天（S9d）OTUs數(shù)量為128個(gè)，占總數(shù)的60.95%。第0天特有的OTUs數(shù)量為10個(gè)，占總數(shù)的4.76%；第3天特有的OTUs數(shù)量為4個(gè)，占總數(shù)的1.90%；第6天特有的OTUs數(shù)量為10個(gè)，占4.76%；第9天特有的OTUs數(shù)量為11個(gè)，占總數(shù)的5.24%；第12天特有的OTUs數(shù)量為12個(gè)，占總數(shù)的5.71%。圖中各橢圓均與其他組橢圓有重疊的部分，表明各組樣品的細(xì)菌物種之間互有交叉，圖1證明了在貯藏期間的三文魚細(xì)菌群落是動(dòng)態(tài)變化的。
圖1三文魚樣品細(xì)菌群落Venn圖
2.2細(xì)菌相對(duì)豐度分析結(jié)果
分別從門、綱、目、科、屬、種6個(gè)水平對(duì)三文魚4℃貯藏期間的細(xì)菌群落相對(duì)豐度進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。貯藏期間三文魚的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門（Proteobacteria）；優(yōu)勢(shì)菌綱為γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）；優(yōu)勢(shì)菌目為弧菌目（Vibrionales）和假單胞菌目（Pseudomonadales）。在科水平的優(yōu)勢(shì)菌為弧菌科（Vibrionaceae）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）和莫拉菌科（Moraxellaceae）。
三文魚4℃貯藏期間屬水平的優(yōu)勢(shì)菌為發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、青枯菌屬（Ralstonia）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），相對(duì)豐度為97%，其中貯藏前期發(fā)光桿菌屬的細(xì)菌在整個(gè)菌相系統(tǒng)中處于優(yōu)勢(shì)地位，相對(duì)豐度為84.89%；而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，假單胞菌屬、青枯菌屬、不動(dòng)桿菌屬的細(xì)菌相對(duì)豐度均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，其中假單胞菌屬的細(xì)菌相對(duì)豐度上升趨勢(shì)最為明顯，在貯藏初期相對(duì)豐度為3.98%，到第12天時(shí)相對(duì)豐度高達(dá)31.46%，并且仍有上升的趨勢(shì)。此外菌相系統(tǒng)中還存在一些如紫色桿菌屬（Janthinobacterium）、希瓦氏菌屬（Shewanella）等細(xì)菌。而在整個(gè)貯藏期間Pseudomonas fragi增長(zhǎng)速度最快，在第0、3、6、9、12天相對(duì)豐度分別為3.01%、4.89%、11.20%、21.99%、24.82%。
圖2三文魚細(xì)菌群落不同分類水平的相對(duì)豐度
2.3優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離鑒定結(jié)果
將1.3.2節(jié)分離、純化后得到菌株進(jìn)行DNA提取和PCR擴(kuò)增，測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的基因序列并與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的微生物基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，選擇與已知的微生物基因序列同源性最高且活性最強(qiáng)（活化培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)菌體濃度最高）的菌株，將其命名為MS 02。如圖3所示，16S rRNA分析結(jié)果證明MS 02為莓實(shí)假單胞菌。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以莓實(shí)假單胞菌MS 02為靶細(xì)菌。
圖3菌株MS 02與其他假單胞菌之間的系統(tǒng)發(fā)育樹
2.4芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的抑菌活性
芳樟醇對(duì)水產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌——莓實(shí)假單胞菌的抑菌活性如表2所示。當(dāng)芳樟醇質(zhì)量濃度為1.00μg/mL時(shí)，莓實(shí)假單胞菌的OD595 nm為0.268±0.014，與陽(yáng)性對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05），但略高于陽(yáng)性對(duì)照組，因此芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的MIC為2.00μg/mL。圖4顯示了芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌MS 02生長(zhǎng)的影響，在細(xì)菌生長(zhǎng)過程中，菌懸液中的細(xì)菌濃度與OD595 nm呈正相關(guān)，因此能夠通過莓實(shí)假單胞菌OD595 nm表征細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況。由圖4可知，空白對(duì)照組莓實(shí)假單胞菌呈指數(shù)型增長(zhǎng)，說明溶劑中的甲醇對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)無明顯影響。加入MIC和2 MIC的芳樟醇后，細(xì)菌生長(zhǎng)明顯受到抑制，MIC組的OD595 nm僅在培養(yǎng)后期有略微增長(zhǎng)，可能是因?yàn)榉颊链紕┝枯^低，且培養(yǎng)時(shí)其易揮發(fā)導(dǎo)致的。
圖4芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌生長(zhǎng)的影響
2.5莓實(shí)假單胞菌的微觀形貌觀察結(jié)果
采用芳樟醇處理后的莓實(shí)假單胞菌的微觀形貌如圖5所示，未添加芳樟醇的莓實(shí)假單胞菌（圖5A）的菌體形態(tài)呈完整且表面光滑的桿狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)添加芳樟醇后，菌體表面隨著芳樟醇添加量的增大出現(xiàn)不同程度的破裂，MIC和2 MIC芳樟醇處理的莓實(shí)假單胞菌如圖5B、C所示，圖5B中菌體表面變得粗糙且不完整，細(xì)胞膜產(chǎn)生明顯的凹陷褶皺，圖5C中的菌體形態(tài)被嚴(yán)重破壞，細(xì)胞膜幾乎完全破裂，內(nèi)容物溶出。上述結(jié)果表明芳樟醇能破壞莓實(shí)假單胞菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄，從而抑制菌的生長(zhǎng)。植物精油因具有疏水性更易作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，破壞胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。
圖5芳樟醇處理后的莓實(shí)假單胞菌SEM圖
2.6芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌電導(dǎo)率的影響
圖6反映了芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌MS 02電導(dǎo)率的影響，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜被抑菌劑損害時(shí)，細(xì)胞膜的半透性喪失，胞內(nèi)電解質(zhì)大量流出，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。空白對(duì)照組菌液電導(dǎo)率變化不明顯，這表明體系中的甲醇不會(huì)破壞細(xì)胞膜的通透性；加入MIC和2 MIC芳樟醇的菌液電導(dǎo)率迅速上升，表明芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的細(xì)胞膜有明顯破壞作用，細(xì)胞膜破損、電解質(zhì)流出導(dǎo)致菌液電導(dǎo)率的上升。
圖6芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌電導(dǎo)率的影響
2.7芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞膜通透性的影響
FDA是一種自身無熒光且不帶電荷的脂質(zhì)性分子，在胞內(nèi)可被酶水解為熒光素發(fā)出熒光，當(dāng)細(xì)胞膜受到破壞，熒光素流失從而導(dǎo)致FDA熒光強(qiáng)度降低。因此，細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性可通過FDA熒光強(qiáng)度來反映。圖7中顯示的是相同處理時(shí)間不同處理?xiàng)l件的FDA熒光強(qiáng)度，50%甲醇處理的熒光強(qiáng)度為1 920 AU，MIC和2 MIC組的熒光強(qiáng)度分別為530、211 AU，可以看出添加芳樟醇的處理組其熒光強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組，這表明50%甲醇不能改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性。但隨著芳樟醇質(zhì)量濃度增加，細(xì)菌細(xì)胞膜被破壞程度逐漸明顯，2 MIC處理組的熒光強(qiáng)度最低，這表明2 MIC芳樟醇處理能明顯破壞莓實(shí)假單胞菌的細(xì)胞膜，這與圖5中2 MIC組菌體形態(tài)被嚴(yán)重破壞，細(xì)胞膜幾乎完全破裂的結(jié)論一致。舒慧珍等在探究檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞膜通透性的影響時(shí)也得到了類似的結(jié)論。
圖7芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌FDA熒光強(qiáng)度的影響
2.7芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞膜完整性的影響
細(xì)胞膜的完整性是菌體正常生長(zhǎng)代謝的重要影響因素，其受到破壞會(huì)導(dǎo)致膜內(nèi)的DNA和RNA等物質(zhì)泄漏，DNA和RNA在260 nm波長(zhǎng)處具有強(qiáng)吸收作用，故可用菌懸液在OD260 nm的變化反映細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性。如圖8所示，在反應(yīng)3 h后，含芳樟醇組菌懸液中的OD260 nm迅速升高，而空白對(duì)照組變化不明顯，這與上文的結(jié)論相一致，說明PCL不會(huì)引起細(xì)菌細(xì)胞膜的破裂。MIC和2 MIC的芳樟醇會(huì)使莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞膜在短時(shí)間內(nèi)破裂，內(nèi)容物迅速流失，對(duì)細(xì)菌細(xì)胞有較明顯的破壞作用。張赟彬等發(fā)現(xiàn)肉桂醛會(huì)使大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜完整性被破壞，內(nèi)容物迅速釋放導(dǎo)致菌液在260 nm波長(zhǎng)處的光密度值增大，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致。
圖8芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞膜完整性的影響
2.8芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌胞內(nèi)酶的影響
鈉鉀ATP酶是一種蛋白酶，存在于組織細(xì)胞及細(xì)胞器膜上，能維持跨膜離子濃度梯度，測(cè)定胞內(nèi)鈉鉀ATP酶的活力變化可以分析抑菌劑對(duì)細(xì)菌細(xì)胞能量代謝的影響。由圖9可知，在培養(yǎng)6 h后，空白對(duì)照組的鈉鉀ATP酶活力最大，而MIC和2 MIC芳樟醇組的鈉鉀ATP酶活力都相對(duì)較小，且明顯可以看出芳樟醇添加量與胞內(nèi)鈉鉀ATP酶活力有直接聯(lián)系。這表明芳樟醇能有效抑制莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞內(nèi)鈉鉀ATP酶的活力，影響細(xì)胞的正常能量代謝。胡文杰等研究表明油樟葉精油的幾種餾分單體也能使尖孢鐮刀菌內(nèi)ATP酶活力下降。
圖9芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌胞內(nèi)酶活力的影響
AKP存在于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，一般難以在胞外被檢測(cè)到，但當(dāng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞后，AKP會(huì)泄漏至細(xì)胞外。因此，可通過檢測(cè)細(xì)菌胞外的AKP活力變化來觀察其對(duì)細(xì)胞壁的破壞情況。由圖9可知，在培養(yǎng)6 h后，空白對(duì)照組AKP活力最高，說明50%甲醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)無影響。但添加MIC和2 MIC芳樟醇后，莓實(shí)假單胞菌AKP活力降低，這表明芳樟醇的加入會(huì)使莓實(shí)假單胞菌的細(xì)胞壁被破壞，導(dǎo)致菌體電解質(zhì)外泄，最終抑制菌體生長(zhǎng)，且隨著芳樟醇添加量的增加，AKP活力降低越明顯。
3結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)采用HTS分析4℃貯藏期間三文魚的菌相結(jié)構(gòu)，并分離提取出1株三文魚優(yōu)勢(shì)腐敗菌——莓實(shí)假單胞菌MS 02，再深入探究芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌MS 02的抑菌機(jī)理。4℃貯藏三文魚的微生物群落多樣性與演替規(guī)律會(huì)隨著時(shí)間延長(zhǎng)而變化。三文魚的優(yōu)勢(shì)菌屬為發(fā)光桿菌屬、假單胞菌屬、青枯菌屬和不動(dòng)桿菌屬。貯藏期間三文魚菌相發(fā)生極大地變化，各菌群之間相互競(jìng)爭(zhēng)，假單胞菌屬的相對(duì)豐度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，莓實(shí)假單胞菌是樣品在貯藏期間的增長(zhǎng)速率最快的菌種。芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌MS 02具有良好的抑菌效果，SEM結(jié)果表明芳樟醇能使細(xì)菌細(xì)胞膜產(chǎn)生凹陷褶皺，而電導(dǎo)率、OD260 nm、FDA熒光強(qiáng)度和AKP、鈉鉀ATP酶活力結(jié)果則證明了芳樟醇能破壞莓實(shí)假單胞菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的通透性和完整性，影響細(xì)菌細(xì)胞正常能量代謝，導(dǎo)致菌體死亡。
利用細(xì)菌生長(zhǎng)曲線表征芳樟醇對(duì)三文魚莓實(shí)假單胞菌MS 02的抑菌效果（一）
利用細(xì)菌生長(zhǎng)曲線表征芳樟醇對(duì)三文魚莓實(shí)假單胞菌MS 02的抑菌效果（二）
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