單一外源微生物的生長繁殖情況研究——誘變菌B38的生長曲線繪制
為實現對土壤修復過程中所加入的單一外源微生物的生長繁殖情況進行跟蹤監測的目的，本論文創新性的引入熒光示蹤技術。使用熒光染料DAPI對誘變菌的DNA 進行標記，與微生物載體諾沃肥復合后，接種于受污染土壤。通過篩選DAPI 染料的使用濃度與菌懸液的稀釋比例，采用熒光計數技術，成功的實現對外源微生物在土壤中的生長繁殖情況的跟蹤研究。為外源微生物生長繁殖的定量化研究提供了一種簡便、快捷的方法，保證生物強化修復技術的順利實施。
培養基及溶液的配制
使用液體牛肉膏~蛋白胨培養基對活性菌株B38進行培養。培養基的配制方法為：準確稱取蛋白胨 10g/L,氯化鈉 5g/L,牛肉膏5g/L,用 1mol/L的鹽酸和 1mol/L的氫氧化鈉調節 pH=7.2,于121℃高壓蒸汽滅菌30min備用。
0.85 %（M/V）生理鹽水的配制：準確稱取0.85g氯化鈉，溶解后用蒸餾水稀釋至 100mL，于121℃下高壓滅菌30min備用。
DAPI 儲備液的配制：用雙蒸水將 DAPI 粉末配制成 1.0×103μg/mL的儲備液，于~20℃保存備用。
DAPI工作液的配制：用磷酸鹽緩沖溶液（PBS,pH=7.4）分別稀釋儲備液至 10μg/mL、0.1μg/mL,制得DAPI工作液，于4℃保存備用。
菌種的培養及生長曲線的測定
本實驗中用到的誘變菌種 B38為實驗室前期以枯草芽孢桿菌為初始菌種，通過紫外誘變5min得到的高效鎘耐受性的誘變菌種。出發菌枯草芽孢桿菌購買自國家普通微生物菌種保藏管理中心（CCGMC）。出發菌株對鎘有一定的抗性，其最小抑制濃度（MIC）為 0.25mmol/L,而選育出的 B38菌種，其抗鎘性能大大提高，MIC達到了3mmol/L.
將B38菌體接種于5mL牛肉膏蛋白胨液體培養基中，于37℃，150r/min活化培養10h至對數生長期中段；之后取 1mL菌懸液接種于 100mL牛肉膏蛋白胨液體培養基，于37℃，150r/min擴大培養。每隔 2h,利用紫外可見分光光度計測定菌懸液的OD600值，并同時對菌懸液進行顯微計數，測定B38的生長曲線。每組實驗設置3個平行。
結果
圖1 B38菌種的生長曲線
誘變菌B38的生長曲線如圖1所示。B38的生長繁殖分為4個階段：調整期（1）、對數期（2）、穩定期（3）和衰亡期（4）。B38在 2h左右進入對數生長期，此階段菌體快速生長，生物量迅速增加；12h后，菌體進入穩定期，活菌數曲線和渾濁度曲線同時達到峰值。處于對數生長期中后段的菌株具有較高的生理活性，因此，選擇培養時間為10h,即培養至對數生長期中后段的菌懸液進行后續實驗。
將12h以內的活菌數與菌懸液的OD600值進行線性回歸，擬合結果見圖 2.從接種期至對數生長期結束，活菌數與菌懸液的 OD600值之間存在顯著正相關關系（r2=0.9766），因而在后續培養實驗中，采用測定對數生長期B38菌懸液OD600值的方法，通過線性回歸計算對細菌數量進行計數，這一發現可顯著提高實驗效率。
結論
為研究土壤中施加外源微生物B38后，其菌體濃度隨時間的變化情況，本文創新性的引入了DAPI熒光染色技術標記微生物的DNA分子進行顯微熒光示蹤計數研究。選擇不同濃度梯度的染料進行對比，結果顯示使用高濃度的工作液鏡檢下熒光反應過強，無法識別單個菌體，最終選擇0.1μg/mL的DAPI為最適濃度。
為能夠對菌體數進行準確計數，選擇不同稀釋倍數進行鏡檢。結果發現當菌懸液稀釋 106倍后，菌體分散度高、數量適中，可實現計數。使用熒光顯微計數得到的 B38 菌體濃度為（3.21± 0.22）×108cells/mL,使用OD600值換算得到的濃度為（4.92±0.15）×108cells/mL,二者達到高度一致，因此熒光染色顯微計數方法準確可行。
將標記后的B38加入土壤中，傳代培養10h后，提取土壤微生物懸液對B38菌體進行熒光計數，所得菌體濃度為（5.58±0.13）×108cells/mL,符合B38的生長曲線。因此經過標記的外源微生物的熒光特性在傳代過程中得到了良好的保持。
在60d的時間內跟蹤外源微生物B38在實際土壤修復過程中的數量變化。結果發現B38對惡劣的環境有較高的適應性和發展潛力；在添加了微生物載體后，由于載體物質為土著微生物和外源微生物同時提供碳源、氮源及其他營養物質，此時，土著微生物對B38的生長繁殖起到了部分競爭抑制作用，但是 B38菌體濃度仍達到（1.05±0.01）×1010cells/mL,與初期施加量相比，提高了近3個數量級，外源微生物得到了良好的生長繁殖。