紅三葉草葉際微生物群落為何對炭疽病具有抵抗力
2025年4月14日，東北農業大學殷秀杰教授團隊在《Microbiological Research》期刊上共同發表了題為“Role of the beneficial phyllosphere microbiome in the defense against red clover anthracnose caused by Colletotrichum americae-borealis”的研究論文。研究通過形態學、分子生物學及多基因系統發育分析，首次確認了Colletotrichum americae-borealis（Cab）是引起中國紅三葉草炭疽病的主要病原體，并探討了有益微生物在增強植物抗病性方面的作用。研究表明，特定細菌如Bacillus J2能夠顯著抑制病原體生長并增強紅三葉草的防御反應。
紅三葉草（Trifolium pratense）是一種重要的牧草資源，在東北地區面臨嚴重的炭疽病威脅。炭疽病由多種病原菌引起，導致葉片枯萎和植株死亡，嚴重影響其產量和質量。盡管已知幾種Colletotrichum屬真菌是全球范圍內紅三葉草炭疽病的主要致病因子，但在中國的具體病原尚未明確。此外，關于紅三葉草葉際微生物群落如何影響其對炭疽病的抵抗力知之甚少。因此，了解這些微生物的作用對于開發有效的生物防治策略至關重要。
1.病原鑒定：通過形態學、分子生物學及多基因系統發育分析，確定Colletotrichum americae-borealis為紅三葉草炭疽病的主要病原體。
2.微生物組變化：高抗性和易感材料在感染后表現出顯著不同的微生物α-和β多樣性，特別是高抗性材料中出現了新的微生物類群和復雜的微生物網絡。
3.關鍵細菌作用：Bacillus J2顯著抑制Cab生長，并通過調控植物激素信號通路增強了宿主的抗病能力。
1.紅三葉炭疽病病原菌鑒定
為了鑒定紅三葉炭疽病病原菌，作者首先從病葉中分離118株菌株，選取18株代表分離物（HTC1-HTC18）在PDA上培養14天進行通過顯微鏡和培養特征觀察，發現其菌落形態、分生孢子及剛毛特征均與C.americae-borealis的描述一致。為驗證其致病性，用分離菌株（HTC1-HTC18）接種健康紅三葉葉片，結果接種植株表現出與田間病株完全一致的癥狀，從而確認了這些菌株的致病性（圖1）。為進一步準確鑒定病原菌種類，作者選取了3株代表菌株（HTC1-HTC3）進行多基因（ITS、GAPDH、HIS、RPB2）測序和親緣關系比對，結合形態學觀察，最終確定引起紅三葉炭疽病的病原菌為C.americae-borealis。
圖1：由Colletotrichum americae-borealis引起的紅三葉草炭疽病癥狀及C.americae-borealis的形態特征
2.16S rRNA基因測序
樣品采集與處理：選擇高抗性材料XJ和易感材料SC進行盆栽實驗，噴施Cab菌懸液為實驗組，無菌水作為對照（圖2）。收集感染和健康葉片樣本，提取表面微生物DNA。接種7天后，分別收集表現出明顯感染癥狀的葉片和無癥狀的健康葉片樣本。收集的葉片置于含有200 mL 0.01 M磷酸鹽緩沖液（PBS）的滅菌容器中，混合物在26°C下以200 rpm的速度搖晃2小時，以確保微生物充分脫離葉片表面并懸浮于PBS中。隨后，洗滌液通過0.22μm的無菌纖維素膜過濾，以捕獲溶液中所有的微生物用于DNA提取（圖2）。
圖2：紅三葉草對炭疽病的抗性評估
測序與數據分析：使用NovaSeq 6000平臺進行測序，獲得高質量的16S rRNA基因序列數據。通過QIIME 2軟件分析，去除低質量序列并進行ASV聚類，計算Shannon多樣性指數（圖3a）。PCoA分析顯示不同處理組間的微生物群落組成差異顯著（圖3b）。
圖3：葉際微生物群落的結構與多樣性
3.共現網絡分析
基于微生物群落的相關性，構建了XJ和SC材料的葉際微生物共現網絡（圖4）。結果顯示，無論是否接種Cab，XJ材料的網絡節點數和邊數均高于SC材料，表明其微生物群落更為復雜且穩定。
圖4：XJ和SC材料葉際微生物共現網絡
4.細菌分離與鑒定
從紅三葉草葉片表面分離出118株細菌，并進一步通過雙培養試驗評估其對病原菌Cab的拮抗作用。其中，Bacillus J2、Pantoea J28和Pseudomonas J83表現出較強的拮抗活性（圖5），平均抑制率分別為69.71%、62.61%和60.68%。此外，Bacillus sp.(J2)、Pantoea aggregata(J28)和Pseudomonas oryzihabitans(J83)的16S rRNA基因序列與ASV_104、ASV_559和ASV_696的序列一致性達到99%。這些結果表明，J2、J28和J83是在接種Cab后XJ中富集的細菌菌株（圖5）。
圖5：葉際微生物分離與鑒定及Cab抑制
5.基因表達分析
為了驗證J2對植物防御機制的影響，研究進行了溫室實驗，預處理易感材料SC后再接種Cab。分別在接種后的第5、7、10和14天監測病情指數，并收集葉片樣本用于RNA提取。qRT-PCR結果顯示，J2顯著上調了多個關鍵防御相關基因（如RPP13、PTI1、NPR1、PR1等）的表達水平（圖6），說明J2通過激活植物免疫系統增強了抗病性。
圖6：J2促進植物生長并增強植物防御基因表達的效果
本研究首次報道了Colletotrichum americae-borealis是中國紅三葉草炭疽病的主要病原體，并揭示了有益微生物尤其是Bacillus J2在增強植物抗病性方面的潛力。通過16S rRNA基因測序、共現網絡分析和基因表達分析等組學手段，詳細解析了紅三葉草葉際微生物群落在應對炭疽病時的變化規律及其對植物健康的積極影響。這些發現不僅加深了我們對植物-微生物互作機制的理解，也為未來開發基于微生物的植物保護策略提供了理論依據。