雙峰駝?dòng)郎衫w維細(xì)胞系的建立方法
體外培養(yǎng)的細(xì)胞壽命一般較短，是影響研究穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素之一。尤其像雙峰駝，主要分布于我國(guó)甘肅、青海、新疆、內(nèi)蒙古等地，對(duì)荒涼、貧瘠、嚴(yán)酷的環(huán)境有良好的適應(yīng)能力，與其他動(dòng)物相比有難以比擬的優(yōu)越性。由于種群稀少、采樣困難、缺乏穩(wěn)定的細(xì)胞資源，雙峰駝(camelus bactrianus)原代細(xì)胞傳代困難，容易衰老，相關(guān)的試驗(yàn)材料及可供參考的資料也非常有限。因此，構(gòu)建雙峰駝?dòng)郎?xì)胞系十分重要。而成纖維細(xì)胞是一種生長(zhǎng)分裂能力較強(qiáng)且功能旺盛的細(xì)胞，存在范圍廣、易獲取，是試驗(yàn)研究中常用的細(xì)胞之一，但也同樣會(huì)面臨衰老、無(wú)法多次傳代等問(wèn)題。染色體末端存在著由多條長(zhǎng)度不同的DNA重復(fù)序列以及蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，稱為“端粒”，它能夠維持染色體位置和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，防止染色體酶解，促進(jìn)細(xì)胞正常生長(zhǎng)。正常的體細(xì)胞染色體末端的端粒會(huì)逐漸縮短，且傳代次數(shù)有限，所以端粒對(duì)于染色體有重要的保護(hù)作用。目前，已經(jīng)有很多物種成功建立起了永生化細(xì)胞系，而且方法多種多樣，通過(guò)自發(fā)永生化、過(guò)表達(dá)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT,telomerase reverse transcriptase)或者病毒癌基因、突變p53和pRb基因、放射法等均可實(shí)現(xiàn)，其中使用最廣泛、報(bào)道最多的便是過(guò)表達(dá)hTERT。已有研究表明，在奶山羊間充質(zhì)干細(xì)胞、田鼠胚胎成纖維細(xì)胞，不同物種的組織細(xì)胞中轉(zhuǎn)入hTERT，細(xì)胞能夠傳代至50～80代，并且細(xì)胞生物學(xué)特性在傳代過(guò)程中保持穩(wěn)定，表明成功建立永生化細(xì)胞系。
現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題：由于目前還沒(méi)有雙峰駝?dòng)郎?xì)胞系，且前人轉(zhuǎn)入hTERT成功建立細(xì)胞系，說(shuō)明此法是可行的、有效的。為了解決雙峰駝研究面臨的問(wèn)題，本試驗(yàn)擬通過(guò)pCI-neo-hTERT質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染Primary BCFs建立永生化細(xì)胞系，并從形態(tài)學(xué)、mRNA水平、蛋白質(zhì)水平分析hTERT介導(dǎo)的細(xì)胞永生化，為以后開(kāi)展雙峰駝的相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。
雙峰駝?dòng)郎衫w維細(xì)胞系的建立方法，具體步驟如下：(1)原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)，(2)細(xì)胞復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)與凍存，(3)細(xì)胞生長(zhǎng)的最適血清與糖濃度測(cè)定，(4)pCI-neo-hTERT載體構(gòu)建和G418最佳濃度篩選及細(xì)胞轉(zhuǎn)染，(5)形態(tài)學(xué)觀察，(6)生長(zhǎng)曲線繪制，(7)免疫熒光檢測(cè)，(8)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，(9)Western Blot檢測(cè)，(10)細(xì)胞周期檢測(cè)。
圖1為不同代次BCFs細(xì)胞形態(tài)；其中，圖1A：BCFs-P5代細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)；圖1B：BCFs-P10代細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)；圖1C：BCFs-P20代細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)；圖1D：BCFs-P30代細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)；圖1E：BCFs-P40代細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)；圖1F：BCFs-P50代細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)；圖1G：BCFs-P60代細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)；圖1H：BCFs-P70代細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)；圖1I：BCFs-P80代細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，100×，標(biāo)尺：100μm。
圖2為Primary BCFs與BCFs Cell lines的生物學(xué)特性分析；圖2A：流式細(xì)胞儀檢測(cè)BCFs-P3與BCFs-P80細(xì)胞周期分布；圖2B：流式細(xì)胞儀檢測(cè)BCFs-P3與BCFs-P80細(xì)胞G1與S期細(xì)胞占比表；圖2C：血細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制BCFs-P3與BCFs-P80生長(zhǎng)曲線；圖2D：CCK-8法繪制BCFs-P3與BCFs-P80生長(zhǎng)曲線。
雙峰駝?dòng)郎衫w維細(xì)胞系的建立和檢測(cè)結(jié)果，具體如下：
1.原代細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果
膠原酶消化法分離原代細(xì)胞，剛接種于培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞還未貼壁，圓形液滴狀細(xì)胞均勻的懸浮在溶液中，形態(tài)未明，貼壁培養(yǎng)1h后，觀察到細(xì)胞正在進(jìn)行貼壁運(yùn)動(dòng)，某些細(xì)胞表面部分貼壁，胞質(zhì)漸漸平攤在瓶底上，折光率開(kāi)始下降。培養(yǎng)4h后，細(xì)胞表面大部分貼壁，24h后大多數(shù)細(xì)胞完成貼壁，胞質(zhì)均勻平攤，細(xì)胞形態(tài)多為長(zhǎng)梭形、多角形、圓形等。在Primary BCFs傳代過(guò)程中發(fā)現(xiàn)從第BCFs-P10左右開(kāi)始，與BCFs-P5相比細(xì)胞形態(tài)嚴(yán)重異常，細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)衰老和變形，并且伴隨著生長(zhǎng)停滯、脫落、死亡等現(xiàn)象。
2.G418篩選結(jié)果
雙峰駝BCFs經(jīng)篩選培養(yǎng)基篩選2周后，根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，可以得到使所有雙峰駝BCFs死亡的最小濃度為400ng/μL，最終篩選陽(yáng)性克隆時(shí)應(yīng)將濃度提高50ng/μL。因此，450ng/μL可作為Primary BCFs G418篩選陽(yáng)性細(xì)胞的最佳濃度。
3.pCI-neo-hTERT質(zhì)粒的獲得與鑒定結(jié)果
試驗(yàn)所用pCI-neo-hTERT質(zhì)粒經(jīng)加入酶切位點(diǎn)后得到質(zhì)粒，質(zhì)粒提取試劑盒提取純化后，使用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)得到OD260/OD280為1.838，質(zhì)粒濃度為673.5ng/μL，說(shuō)明所提取的質(zhì)粒純度較高，沒(méi)有明顯的蛋白質(zhì)、RNA、酚類(lèi)物質(zhì)、胍鹽等污染，滿足后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染需要。質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定。
4細(xì)胞生長(zhǎng)最適血清與糖濃度確定
CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)血清及糖濃度的依賴性，結(jié)果：BCFs-P3與BCFs-P80對(duì)血清的依賴性相似。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)BCFs-P3與BCFs-P80皆不能在無(wú)血清的環(huán)境中生長(zhǎng)，在無(wú)血清條件下培養(yǎng)24h即有細(xì)胞脫落、死亡。5％FBS、10％FBS、15％FBS均可明顯提高Primary BCFs與BCFs Cell lines的分裂能力(P＆lt;0.05)。說(shuō)明Primary BCFs與BCFsCell lines均具有血清依賴性，血清是促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)分裂的重要因素之一，且10％FBS為該細(xì)胞培養(yǎng)的最佳血清濃度。以同樣的方法檢測(cè)了培養(yǎng)基中葡萄糖濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果：BCFs-P3與BCFs-P80對(duì)培養(yǎng)基中糖濃度的依賴性一致，與4.5g/L相比，0g/L、2g/L和9g/L糖濃度條件下細(xì)胞增殖能力顯著下降(P＆lt;0.01)，說(shuō)明BCFs-P3與BCFs-P80在過(guò)低或過(guò)高糖濃度的環(huán)境下細(xì)胞分裂均會(huì)受到阻礙，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基最適糖濃度為4.5g/L。
5細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果
在永生化細(xì)胞系的建立過(guò)程中，利用德國(guó)ZEISS倒置顯微鏡成像系統(tǒng)記錄了形態(tài)良好、具有典型成纖維細(xì)胞特征的雙峰駝Primary BCFs與BCFs Cell lines。如圖1A：BCFs-P5代細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)；圖1B為BCFs-P10代細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)；圖1C為BCFs-P20代細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)；圖1D為BCFs-P30代細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)；圖1E：BCFs-P40代細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)；圖1F為BCFs-P50代細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)；圖1G為BCFs-P60代細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)；圖1H為BCFs-P70代細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)；圖1I為BCFs-P80代細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)。Primary BCFs傳代到第10代左右，細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始出現(xiàn)異常，逐漸變得細(xì)長(zhǎng)、活力下降，并且伴隨著貼壁能力減弱、生長(zhǎng)停滯等細(xì)胞衰老的現(xiàn)象。在不斷轉(zhuǎn)染hTERT質(zhì)粒后細(xì)胞形態(tài)逐漸開(kāi)始穩(wěn)定，細(xì)胞死亡率下降，由此可以推測(cè)轉(zhuǎn)染hTERT質(zhì)粒后已初步構(gòu)建雙峰駝?dòng)郎?xì)胞系。
6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫熒光及Western Blot鑒定Primary BCFs與BCFs Celllines
波形蛋白(vimentin,VIM)是成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)志物之一，是中間絲蛋白的其中一種，通過(guò)細(xì)胞免疫熒光染色來(lái)檢測(cè)成纖維細(xì)胞特性，在熒光顯微鏡下顯示BCFs-P3與BCFs-P80大多數(shù)胞質(zhì)呈綠色(黑白圖為較亮處)熒光，細(xì)胞核DAPI染色呈藍(lán)色(黑白圖為較亮處)，波形蛋白染色為陽(yáng)性。細(xì)胞界限清晰，大小均一，表現(xiàn)出成纖維細(xì)胞特性。而角蛋白18(CK18)是上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物之一，VIM和CK18實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定結(jié)果，以MAC-T上皮細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照，Primary BCFs與BCFs Cell lines各代次VIM相對(duì)表達(dá)量較高，而CK18的相對(duì)表達(dá)量較低。表明Primary BCFs細(xì)胞仍為混合細(xì)胞，存在上皮樣細(xì)胞，但經(jīng)轉(zhuǎn)染hTERT以及G418篩選后BCFs Cell lines各代次純度越來(lái)越高，BCFs Cell lines大部分為成纖維細(xì)胞。Western Blot結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果一致，表明BCFs Cell lines為成纖維細(xì)胞。
7.Primary BCFs與BCFs Cell lines的生物學(xué)特性分析及外源性hTERT的整合與表達(dá)
分別利用CCK-8法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)法對(duì)Primary BCFs與BCFs Cell lines進(jìn)行活力測(cè)定。從圖2C、D可知，雙峰駝BCFs-P3與BCFs-P80的生長(zhǎng)曲線均呈“S”型，在培養(yǎng)1～2d時(shí)，細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有太大的變化，此時(shí)的細(xì)胞處于潛伏期；培養(yǎng)了3d后細(xì)胞開(kāi)始快速生長(zhǎng)，此時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；培養(yǎng)6d時(shí)，細(xì)胞分裂能力減弱，生長(zhǎng)速度減緩；培養(yǎng)7～8d時(shí)，細(xì)胞數(shù)量基本維持不變，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入了平臺(tái)期。BCFs傳至10代左右時(shí)，其分裂能力開(kāi)始下降，表明了BCFs經(jīng)過(guò)多次傳代后細(xì)胞逐漸出現(xiàn)了衰老、變形等問(wèn)題。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)周期結(jié)果如圖2A和表B所示：BCFs-P3處于G1期的細(xì)胞比例為82.95％a，處于S期的細(xì)胞為8.12％b；BCFs-P80處于G1期的細(xì)胞比例為50.46％a，S期的細(xì)胞為39.83％b，且差異顯著(P＆lt;0.05)。該結(jié)果表明：BCFs-P80在G1期的生長(zhǎng)停滯比例顯著低于BCFs-P3，且BCFs-P80在S期的細(xì)胞占比顯著高于BCFs-P3，再結(jié)合BCFs-P3與BCFs-P80的生長(zhǎng)曲線可以證明BCFs Cell lines細(xì)胞分裂增殖能力更強(qiáng)，增殖速度更快，BCFs Cell lines并不受S期阻滯，增值活力旺盛。
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