大腸桿菌噬菌體Bp4抗性菌株與其敏感菌株培養(yǎng)特性及耐藥性檢測（一）
早在上世紀30～40年代噬菌體就被用于治療細菌感染，但隨著抗生素的發(fā)現(xiàn)，因其高效殺菌、使用方便、價格便宜的特點，抗生素很快在世界各地得到廣泛應(yīng)用，逐漸代替了噬菌體。近年來，由于抗生素的濫用致使細菌耐藥性產(chǎn)生甚至不斷出現(xiàn)了多重耐藥菌，尋找抗生素的替代品是目前的當務(wù)之急。噬菌體是能夠特異性感染細菌的病毒[1]，具有特異性的宿主識別譜，可實現(xiàn)對細菌的快速特異殺滅，其殺菌作用不受細菌耐藥性的限制，且噬菌體具有研發(fā)周期短、投入成本低、安全性高等優(yōu)點，成為最有影響力的抗生素替代品之一[2-3]。因此噬菌體療法的研究及臨床應(yīng)用逐漸得到重視。
在細菌與噬菌體共同進化過程中，細菌不斷演化出抵抗噬菌體的機制，噬菌體抗性菌的出現(xiàn)成為噬菌體治療中的難題[4]，噬菌體的抗性菌會不會像抗生素抗性菌一樣最終面臨無藥可治的境地？噬菌體抗性細菌的出現(xiàn)往往與細菌的自發(fā)突變和適應(yīng)性有關(guān)，且往往與噬菌體吸附受體的修飾有關(guān)。主要的噬菌體抗性機制是噬菌體抗性菌株能夠通過表面修飾對噬菌體進行防御[5]。樂率研究發(fā)現(xiàn)，綠膿桿菌通過細胞表面外膜脂多糖的丟失從而產(chǎn)生了噬菌體抗性，且抗性菌的毒力顯著下降[6]。本實驗室前期分離到一株大腸桿菌噬菌體Bp4，屬于短尾噬菌體科N4類噬菌體，能夠裂解O78血清型的大腸桿菌。
本研究通過雙層平板法篩選大腸桿菌噬菌體的抗性突變株，將其與大腸桿菌敏感菌株進行了形態(tài)及培養(yǎng)特性觀察、血清型及耐藥性檢測、基因組測序分析等研究，以期為噬菌體治療中噬菌體抗性菌的研究提供參考依據(jù)。
1材料與方法
1.1主要實驗材料
大腸桿菌噬菌體Bp4、大腸桿菌血清O78型敏感菌株（后簡稱O78型敏感菌株）均由本實驗室保存；BALB/c小鼠購自青島大任富城畜牧有限公司。營養(yǎng)瓊脂、LB肉湯、瓊脂粉均購自生工生物工程（上海）有限公司；大腸桿菌O抗血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。
1.2噬菌體抗性突變菌株的篩選與鑒定
將噬菌體Bp4的宿主菌（O78型敏感菌株）接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃220 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期后取200μL與200μL噬菌體Bp4的增殖液一起加入5 mL LB中，37℃220 r/min振蕩培養(yǎng)，觀察液體的渾濁狀態(tài)；在約3 h液體清亮后繼續(xù)振蕩培養(yǎng)過夜至渾濁，用接種環(huán)采用三線法將該噬菌體增殖液接種于LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜。將LB平板上長出的單菌落連續(xù)純化4代，將第4代純培養(yǎng)的單菌落再與噬菌體Bp4經(jīng)液體培養(yǎng)后再經(jīng)雙層平板法培養(yǎng)[7]，即用接種環(huán)挑取第4代純培養(yǎng)的單菌落接種于5 mL LB中，37℃220 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取110μL菌液與110μL噬菌體Bp4增殖液混勻后于37℃孵育5 min，取200μL孵育液加至已溶解的上層瓊脂中，混勻后迅速傾倒在下層營養(yǎng)瓊脂上，晃勻待凝固后37℃倒置培養(yǎng)6 h～8 h，設(shè)不加噬菌體的敏感菌株為陽性對照。觀察噬菌斑產(chǎn)生情況，不產(chǎn)生噬菌斑的菌株即為對噬菌體Bp4具有抗性的大腸桿菌突變菌株，命名為大腸桿菌O78-R型抗性菌株（后簡稱O78-R抗性菌株）。
1.3敏感菌株與抗性菌株的形態(tài)及培養(yǎng)特性
觀察將O78型敏感菌株與O78-R抗性菌株分別在普通營養(yǎng)瓊脂及麥康凱瓊脂上劃線培養(yǎng)，37℃16 h后觀察菌落形態(tài)，挑取單菌落經(jīng)革蘭氏染色觀察。挑取單菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃220 r/min振蕩過夜培養(yǎng)，利用傾注平板法[8]測定菌液濃度：將菌液10倍倍比稀釋至107倍，分別選取105和107稀釋度的菌懸液各1 mL于無菌培養(yǎng)皿中，然后將約50℃營養(yǎng)瓊脂注入平板中晃勻，試驗重復(fù)兩次；待瓊脂凝固后，將平板倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)24 h左右，經(jīng)細菌計數(shù)評估兩種細菌的生長速度。
1.4敏感菌株與抗性菌株的基因組測序及序列
分析將純化的O78型敏感菌株及O78-R抗性菌株由北京安諾優(yōu)達基因科技有限公司測序，根據(jù)測序結(jié)果分析比較抗性菌株與敏感菌株基因組的差異。
1.5敏感菌株與抗性菌株的血清型鑒定
將O78型敏感菌株與O78-R抗性菌株分別接種于5 mL LB肉湯中，37℃220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，4 000 r/min離心10 min，棄上清，用0.5%石炭酸生理鹽水2 mL懸浮后121℃高壓2 h，以破壞細菌的莢膜“K”抗原，制成高壓抗原，以大腸桿菌O抗血清為抗體，利用玻板凝集法鑒定大腸桿菌的“O”抗原血清型。
1.6敏感菌株與抗性菌株的耐藥性檢測參照文獻[9]采用藥敏K-B紙片法分別檢測O78型敏感菌株及O78-R抗性菌株對12種藥物的敏感性，根據(jù)歐盟藥敏試驗標準判定結(jié)果。
1.7敏感菌株與抗性菌株的致病性試驗將20只BALB/c小鼠隨機分為兩組，每組10只，分別腹腔注射O78型敏感菌株新鮮菌液及O78-R抗性菌株新鮮菌液0.2 mL（菌液濃度均為1×108cfu/mL），統(tǒng)計感染后72 h內(nèi)兩組小鼠的發(fā)病率和死亡率，并統(tǒng)計感染后12 h、24 h、36 h、48 h、72 h時每組小鼠的臨床癥狀得分，判定標準為：死亡0分，瀕臨死亡1分，部分閉眼、眼周有滲出液2分，嗜睡、弓背3分，運動減少、被毛粗亂為4分，正常、健康者5分，繪制患病小鼠的計分及其存活率曲線。
2結(jié)果
2.1噬菌體抗性菌株的篩選與鑒定結(jié)果
分別取200μL培養(yǎng)至對數(shù)期的O78型敏感菌株菌液及噬菌體Bp4增殖液于5 mL肉湯中，振蕩培養(yǎng)，可觀察到液體從清亮-渾濁-清亮-渾濁的變化，取最后渾濁的液體劃線傳代，用噬菌體Bp4再感染第4代的菌液，液體一直處于渾濁狀態(tài)，初步判斷噬菌體Bp4不再感染該菌株；用第4代的菌液與噬菌體Bp4經(jīng)雙層平板培養(yǎng)6 h～8 h不再產(chǎn)生噬菌斑，而O78型敏感菌株的平板則產(chǎn)生了明顯的噬菌斑（圖1）。表明宿主菌（敏感菌株O78型）在與噬菌體Bp4相互作用中產(chǎn)生了對噬菌體Bp4耐受的菌株，即抗性菌株O78-R。
圖1噬菌體Bp4抗性菌株的篩選與鑒定結(jié)果
2.2敏感菌株與抗性菌株的形態(tài)及培養(yǎng)特性
結(jié)果將抗性菌株與敏感菌株進行了形態(tài)及培養(yǎng)特性的比較，發(fā)現(xiàn)兩株菌的菌落形態(tài)相同，在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上均呈表面光滑、半透明的單菌落（圖2），在麥康凱培養(yǎng)基上呈粉紅色小菌落，表面光滑。且抗性菌株與敏感菌株的生長速度相同，105稀釋度的兩株菌菌懸液生長的單菌落數(shù)量太多不予計數(shù)，107稀釋度兩株菌的菌懸液在37℃培養(yǎng)24 h時均生長出30個單菌落，且重復(fù)實驗結(jié)果相同。表明，抗性菌株與敏感菌株的形態(tài)及培養(yǎng)特性相同，生長速度一致。
圖2 O78敏感菌株與O78-R抗性菌株在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果
大腸桿菌噬菌體Bp4抗性菌株與其敏感菌株培養(yǎng)特性及耐藥性檢測（一）
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