鼠李糖乳桿菌生長曲線、溫度誘導(dǎo)對菌體生長速率的影響
鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusGG，LGG)屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)，最適生長溫度37℃，兼性厭氧[1-2]。LGG由兩位美國科學(xué)家Sherwood Gorbach和Barry Goldin在上世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)，該菌分離自健康人體腸道[3]，大量研究證明LGG能夠定植于腸道，通過調(diào)節(jié)腸道菌群，起到抵御病原微生物的侵襲等作用，具有預(yù)防和治療腹瀉、預(yù)防呼吸道感染、預(yù)防齲齒、抗過敏的作用，提高機(jī)體免疫力等功效[4]，LGG在酸奶、飲料、奶粉、奶酪、保健品等均有應(yīng)用。
通常，LGG可通過液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝獲得，進(jìn)一步通過冷凍干燥的方法獲得菌粉，菌粉是微生物的最佳保存方式，然而冷凍干燥會不可避免的造成乳桿菌細(xì)胞膜的損傷，具體的損傷包括:機(jī)械損傷、溶質(zhì)損傷、細(xì)胞膜滲透性損傷[5]、蛋白質(zhì)變性失活、pH平衡的破壞和細(xì)胞膜脂肪酸的變化[6-7]。然而，微生物也會通過改變膜的流動性和改變蛋白質(zhì)的翻譯來適應(yīng)低溫環(huán)境。冷休克蛋白(cold shock proteins，Csps)是微生物為適應(yīng)低溫環(huán)境產(chǎn)生的應(yīng)激蛋白，大腸桿菌在低溫誘導(dǎo)過程中會產(chǎn)生大量GspA蛋白，可占到細(xì)胞總蛋白合成的13%，隨后又發(fā)現(xiàn)了8中同源性蛋白:CspB、CspC、CspD、CspE、CspF、CspG、CspH、CspI蛋白[8]。枯草芽孢桿菌在低溫環(huán)境下有13個(gè)Csps蛋白被誘導(dǎo)產(chǎn)生。在低溫條件下Csps蛋白可以作為RNA的分子伴侶，與mRNA結(jié)合，穩(wěn)定RNA，促進(jìn)菌體在低溫條件下轉(zhuǎn)錄并翻譯[9]，其中CspA、CspB、CspG、CspI蛋白在低溫誘導(dǎo)下產(chǎn)生，CspC、CspE蛋白在正常培養(yǎng)條件下產(chǎn)生[10，11]。然而，與CspA蛋白不同的是CspC蛋白的表達(dá)量隨溫度的升高而降低，使用基因敲除的方法去除大腸桿菌的cspc基因后，發(fā)現(xiàn)菌體的生長明顯加快[12]。說明CspC有抑制菌體生長的作用，因此在生長過程中抑制CspC蛋白的表達(dá)可能會有利于提高菌體的生長速率。然而對于LGGcspcmRNA基因的研究還未見報(bào)道。
本文通過對LGG進(jìn)行溫度誘導(dǎo)處理，通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)的方法檢測cspc的表達(dá)，并且對誘導(dǎo)后的菌體進(jìn)行生長速率的測定，以考察溫度誘導(dǎo)對cspcmRNA基因表達(dá)的影響，以及對菌體生長速率的影響，揭示cspcmRNA基因與生長速率的關(guān)系，為提高LGG的產(chǎn)量提供一定的理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料與儀器
鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusGG，LGG)GD20150520內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實(shí)驗(yàn)室;酪蛋白胨、酵母粉、牛肉粉北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸三銨、吐溫-80、MgSO4、K2HPO4、瓊脂粉國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;cspc基因引物序列(F:5′-TGATAA GGGTTACGGCTTCA′，R:5′-GGCCACGATCAGATTG TTCTAC-3′)，產(chǎn)物長度140 bp、16S rDNA引物序列(F:5′-TAGCGTACCATCTGATCCAGTA′，R:5′-GAAGTCGTCGCGTTGACA-3′)，產(chǎn)物長度187 bp美國Invitrogen;RNA提取試劑盒(RNAiso PlusD9108A)、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent KitDRR037A)、RT-PCR試劑盒日本Takara。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1鼠李糖乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)菌種采取四級發(fā)酵培養(yǎng)方法，一、二、三級為種子擴(kuò)大培養(yǎng)基，四級為最終發(fā)酵培養(yǎng)基，一級培養(yǎng)基接入0.3 g的凍干菌種，混勻，放置恒溫厭氧培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)16 h。二級培養(yǎng)基由培養(yǎng)好的一級發(fā)酵液按4%的接種量接入，培養(yǎng)12 h。以此類推，傳代到四級最終發(fā)酵培養(yǎng)基。
1.2.2活菌數(shù)的測定采用平板混菌計(jì)數(shù)法[13]。
1.2.3生長曲線測定四級發(fā)酵液按不同的時(shí)間點(diǎn)(0、1、2、3、4、6、8、10、12、16、20 h)取樣，測定發(fā)酵液活菌數(shù)，制作生長曲線。
1.2.4cspcmRNA基因表達(dá)量法檢測mRNA的表達(dá)量根據(jù)GenBank上報(bào)道的鼠李糖乳桿菌的cspc基因序列，利用Prime5.0軟件設(shè)計(jì)RT-PCR法檢測cspc基因的引物。提取鼠李糖乳桿菌總RNA，按試劑盒說明書方法操作，用酶標(biāo)儀檢測RNA純度，OD260/OD280在1.8～2.0為符合要求的RNA。反轉(zhuǎn)錄cDNA，按照試劑盒說明操作，RNA上樣量為2.0μL(約500 ng)，反應(yīng)條件:37℃，15 min;85℃，5 s結(jié)束反應(yīng)，得到cDNA。
熒光定量PCR，按照試劑盒說明書方法操作，以cDNA為模板，加入cspc基因的引物，通過實(shí)時(shí)熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Real time PCR，RT-PCR)方法擴(kuò)增cspc基因。反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃30 s;變性95℃5 s，退火60℃34 s讀板，共40個(gè)循環(huán);從65℃到95℃制作融解曲線。以16s rDNA為內(nèi)參基因，以確定cspcmRNA基因的相對表達(dá)量。產(chǎn)物做電泳檢測分析，膠回收，產(chǎn)物送測序Invitrogen公司，NCBI blast比對分析。
RT-PCR所獲得的數(shù)據(jù)，利用2-ΔCt(ΔCt=cspc基因Ct值-16S rRNA Ct值)公式進(jìn)行cspcmRNA基因在LGG中相對表達(dá)量計(jì)算。
1.2.5溫度誘導(dǎo)cspcmRNA基因表達(dá)試驗(yàn)將鼠李糖乳桿菌四級發(fā)酵液分別置于37、39、41、43、45℃的恒溫水浴中分別處理10、15、20、25、30 min，即按照5組(溫度)×5組(時(shí)間)設(shè)計(jì)，共25組試驗(yàn)，每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，37℃為對照組。RT-PCR法檢測cspcmRNA基因的表達(dá)量[14]。
1.2.6溫度誘導(dǎo)后菌體的生長速率測定在三級發(fā)酵接種到四級培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h時(shí)，即菌體進(jìn)入對數(shù)生長期后，按1.2.5確定的最佳誘導(dǎo)溫度和時(shí)間進(jìn)行溫度誘導(dǎo)，之后繼續(xù)培養(yǎng)4 h再次進(jìn)行溫度誘導(dǎo)，之后再繼續(xù)培養(yǎng)12 h結(jié)束發(fā)酵。RT-PCR法檢測菌體的cspcmRNA基因表達(dá)量，活菌數(shù)法測定菌體生長曲線，并計(jì)算生長速率，生長速率=(lg活菌數(shù)t1-lg活菌數(shù)t0)/(t1-t0)(t1、t0表示發(fā)酵時(shí)間點(diǎn))，以未進(jìn)行溫度誘導(dǎo)作為對照[14]。
1.2.7凍干驗(yàn)證試驗(yàn)為了考察溫度誘導(dǎo)對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響，在終止發(fā)酵后對菌體進(jìn)行冷凍干燥[14]。鼠李糖乳桿菌四級發(fā)酵誘導(dǎo)組、對照組，發(fā)酵液經(jīng)10000 r/min離心20 min，棄去上清液，保留菌體，加入凍干保護(hù)劑(凍干保護(hù)劑:25%脫脂奶粉、10%乳糖、10%抗壞血酸)混勻，-40℃預(yù)冷30 min，真空干燥36 h得到凍干菌粉。菌粉懸溶于100 mL PBS中混勻，活菌數(shù)法測定混懸液的活菌數(shù)，計(jì)算凍干菌粉總活菌數(shù)(凍干菌粉總活菌數(shù)=混懸液活菌數(shù)濃度×100 mL)。根據(jù)發(fā)酵液總活菌數(shù)(發(fā)酵液總活菌數(shù)=發(fā)酵液活菌數(shù)濃度×發(fā)酵液體積)，計(jì)算凍干存活率。凍干存活率(%)=凍干菌粉總活菌數(shù)/發(fā)酵液總活菌數(shù)×100。
1.3數(shù)據(jù)處理
每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，應(yīng)用Tukey test檢驗(yàn)進(jìn)行分析，p<0.05表示差異顯著，p<0.01表示差異極顯著。
2結(jié)果與分析
2.1鼠李糖乳桿菌生長曲線
鼠李糖乳桿菌生長曲線如圖1。
圖1鼠李糖乳桿菌生長曲線
如圖1所示，鼠李糖乳桿菌生長良好，0～3 h是菌體的適應(yīng)期，3～12 h是菌體的對數(shù)生長期，12～16 h是菌體的穩(wěn)定生長期，16 h之后菌體進(jìn)入衰退期。
2.2鼠李糖乳桿菌cspc基因克隆及電泳驗(yàn)證
鼠李糖乳桿菌cspc基因克隆電泳結(jié)果見圖2。
圖2 cspc基因RT-PCR電泳結(jié)果
如圖2所示鼠李糖乳桿菌cspc基因克隆片段，大小為140 bp，產(chǎn)物經(jīng)電泳、膠回收、測序、比對，確認(rèn)為cspc目標(biāo)基因。
2.3溫度誘導(dǎo)對cspc mRNA基因表達(dá)的影響
CspC蛋白是CspA蛋白家族中的一個(gè)成員，與CspA蛋白不同的是，CspC蛋白不需要低溫誘導(dǎo)表達(dá)，在37℃即可表達(dá)，研究顯示[15-16]，CspC蛋白與染色體凝集和細(xì)胞分裂有關(guān)，并且有抗轉(zhuǎn)錄終止的作用。Shenhar等[17]研究表明，CspC蛋白可以促進(jìn)細(xì)菌脅迫應(yīng)答因子(RpoS)的表達(dá)，RpoS是微生物在環(huán)境壓力產(chǎn)生的適應(yīng)性因子，因此可以說CspC蛋白是微生物對抗環(huán)境壓力的重要因子。然而，其具體的生物學(xué)功能還不是十分明確。與CspA蛋白不同的是，CspC蛋白的表達(dá)量隨溫度的升高而降低，然而對于鼠李糖乳桿菌cspcmRNA基因的研究還未見報(bào)道。本研究通過升高溫度抑制LGGcspcmRNA基因的表達(dá)，如圖3所示，在對照37℃時(shí)，不同的作用時(shí)間對其表達(dá)量沒有影響，而在溫度高于37℃時(shí)，菌體cspcmRNA基因的表達(dá)量明顯下調(diào)，說明溫度升高可以抑制菌體產(chǎn)生cspcmRNA基因，且在43℃誘導(dǎo)30 min，菌體cspcmRNA基因的表達(dá)量最低，且差異極顯著(p<0.01)。
圖3溫度誘導(dǎo)后csps mRNA基因的相對表達(dá)量
2.4溫度誘導(dǎo)后菌體的生長速率測定結(jié)果
本研究中，通過升高溫度抑制菌體cspcmRNA基因的表達(dá)，結(jié)果如圖4所示，在接種后生長第4和8 h，菌體經(jīng)43℃、30 min誘導(dǎo)，菌體cspcmRNA基因的表達(dá)明顯降低，而隨著溫度降至37℃，cspcmRNA基因的表達(dá)又恢復(fù)到原來水平。如圖5所示，經(jīng)過誘導(dǎo)后的鼠李糖乳桿菌生長明顯加快，且活菌數(shù)明顯升高。如圖6所示，經(jīng)過兩次誘導(dǎo)后，與對照組相比，誘導(dǎo)組4～6 h以及8～10 h的生長速率明顯增高，差異顯著(p<0.05)，而6～8 h和10～12 h兩組的生長速率差異不顯著。
圖4溫度誘導(dǎo)條件下菌體cspc mRNA基因的相對表達(dá)量
圖5溫度誘導(dǎo)條件下菌體的生長曲線
圖6溫度誘導(dǎo)條件下菌體4～12 h的生長速率
2.5鼠李糖乳桿菌凍干驗(yàn)證試驗(yàn)
如圖7所示，誘導(dǎo)組與對照組相比，其凍干存活率無明顯差異，說明溫度誘導(dǎo)只影響菌體的生長速率，并不影響菌體的凍干存活率。
圖7菌體凍干存活率驗(yàn)證結(jié)果
3結(jié)論
本研究對鼠李糖乳桿菌進(jìn)行不同溫度和時(shí)間的誘導(dǎo)處理，考察cspcmRNA基因的表達(dá)量，并考察在溫度誘導(dǎo)后菌體的生長速率，結(jié)果顯示，經(jīng)43℃、30 min誘導(dǎo)，菌體cspcmRNA基因的表達(dá)明顯降低，且誘導(dǎo)后菌體的生長速率明顯升高，溫度誘導(dǎo)相比基因敲除具有安全的優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于鼠李糖乳桿菌規(guī)模化發(fā)酵過程中，以提高菌體的產(chǎn)量。此外，研究顯示，通過兩次溫度誘導(dǎo)，鼠李糖乳桿菌的凍干存活率并未下降，也證明了該方法的可行性。
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