羅爾阿太菌生長曲線、原生質體制備條件及融合技術（四）
2.4融合條件對原生質體融合率的影響
融合條件對原生質體融合率的影響見圖3，由圖3a可以看出，隨著PEG6000濃度的增加，原生質體融合率先增加后降低。當PEG6000為0.4 g·mL——1時，原生質體融合率為6.792%.原因可能是PEG6000在原生質體融合過程中既作為誘導劑又作為穩定劑，濃度低時誘導作用不明顯，濃度高時原生質體不穩定易破裂，致使原生質體融合率降低。
由圖3b可以看出，隨著融合時間的增加，原生質體融合率先增加后降低。當融合時間為25 min時，原生質體融合率為6.543%.可能原因是融合時間短，原生質體融合不完全。融合時間長，PEG6000會對細胞造成毒害作用，致使原生質體融合率降低。
由圖3c可以看出，隨著融合溫度的增加，原生質體融合率先增加后降低。當融合溫度為30℃時，原生質體融合率為6.452%.原因可能是融合溫度低時達不到融合條件，融合溫度高時抑制PEG6000作用，致使原生質體融合率降低。
圖3融合條件對原生質體融合率的影響
2.5融合子的篩選
2.5.1原生質體融合子形態
原生質體融合子形態見圖4，原生質體經紫外和熱處理滅活后，致死率為100%，在雙層再生培養基上不再生長。原生質體融合后在再生培養基上長出融合子，最初是1個白色圓形的點，隨后菌絲向外萌發生長，通常需要6——9 d.
圖4原生質體融合子形態
2.5.2篩選菌株多糖及草酸含量經原生質體融合篩選出了4個菌株，分別命名為AY-1、AY-2、AY-3、AY-4，在發酵培養基中培養5.5 d后測得多糖及草酸產量見表3.
表3篩選菌株的多糖和草酸產量
表中數據為平均值±標準誤（n=3），同列數據后凡是有一個相同小寫字母者，表示差異不顯著（Duncan’s法，P＞0.05）。
由表3可以看出，經原生質體融合選育的菌株中，除菌株AY-1的多糖產量下降外，其他菌株多糖產量都高于Ar-1和Ar-2，菌株AY-3和AY-4多糖產量較高，分別比原始菌株的產糖量提高了54.42%和45.18%.此外，菌株AY-3草酸產量最低，為0.281 g·L——1，比原始菌株的草酸產量降低了43.57%.菌株AY-1、AY-2、AY-3、AY-4多糖產量均與原始菌株差異顯著（P＜0.05）。草酸產量除菌株AY-4與原始菌株差異不顯著外（P＞0.05），菌株AY-1、AY-2、AY-3均與原始菌株差異顯著（P＜0.05）。菌株AY-3的多糖產量、多糖產量變化、草酸產量、草酸產量變化均與其他菌株差異顯著（P＜0.05），為最佳產糖菌株。
3討論與結論
真菌原生質體融合技術不僅打破了微生物種界界限，還能保持完整的遺傳物質，從而完成菌株基因重組，重組后的融合子具有雙親遺傳性狀，能夠表現出雙親的優良性狀。本研究中以羅爾阿太菌菌株AY6657741為原始菌株，誘變株Ar-1和Ar-2為雙親菌株，以玉米淀粉和玉米黃漿為培養基，采用原生質體融合技術選育的羅爾阿太菌菌株多糖產量高達24.673 g·L——1.本試驗中多糖產量與Shrikant等的研究相比，產糖量提高了10.54%.這表明原生質體融合技術能較好地提高羅爾阿太菌分泌多糖的能力，為今后進一步提高多糖產量奠定了基礎。
本試驗中采用紫外照射和熱處理方法滅活雙親原生質體，但紫外處理和熱處理在一定條件下有可逆性，因此融合培養后的菌株具有不穩定性，其性狀特征可能很快失去，所以必須傳代數次保證其性狀的穩定性。另外在發酵過程中發現，伴隨多糖的產生，會生成草酸，使發酵液pH由4.55很快降至2.00左右，從而抑制了多糖的分泌，當草酸產量高于0.368 g·L——1時，多糖產量就會受到影響。采用原生質體融合技術選育出的菌株AY-3滿足了草酸低產，多糖高產的要求。
目前高產羅爾阿太菌多糖生產專利技術由Cargill公司擁有，我國只能依賴進口。本研究中獲得的菌株AY-3可為我國獲得擁有自主知識產權的羅爾阿太菌多糖工藝技術奠定了一定的理論基礎。今后的研究將進一步探討AY-3生產多糖的工藝，以期為該糖工業化生產奠定基礎。
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