羅爾阿太菌生長曲線、原生質體制備條件及融合技術（一）
摘要：【目的】選育羅爾阿太菌多糖高產，草酸低產的優良羅爾阿太菌菌株。【方法】采用原生質體融合技術，以羅爾阿太菌菌株AY6657741為原始菌株，以紫外和亞硝基胍復合誘變的2株多糖高產的誘變株Ar-1和Ar-2為雙親菌株；通過正交試驗優化原生質體的制備條件。【結果和結論】5.56 mmol·L-1的β-巰基乙醇處理菌懸液，0.4 mol·L-1的KCl作為滲透壓穩定劑，3.1 mg·m L-1的復合酶液（纖維素酶φ為2%，蝸牛酶φ為2%，溶壁酶φ為4%），p H 5.5，32℃酶解55min，原生質體形成率93.534%，再生率18.921%.0.4 g·m L-1的聚乙二醇6000在30℃條件下融合25 min，選育出1株多糖高產，草酸低產的菌株，命名為AY-3.菌株AY-3多糖產量達24.673 g·L-1，比原始菌株AY6657741的產糖量提高了54.42%，草酸質量濃度降低至0.281 g·L-1，比原始菌株草酸的質量濃度降低了43.57%.
羅爾阿太菌Athelia rolfsii是擔子菌門阿太菌屬的一種真菌，無性世代為齊整小核菌，白色菌落，菌絲呈放射狀生長，能分泌多糖。該多糖是一種非離子型、水溶性的同聚多糖，包含β-D-（1→3）~吡喃葡萄糖基和β-D-（1→6）~吡喃葡萄糖基線性鏈。具有水溶性、組織相容性、增稠性、抗水解能力及在高溫下保持黏度的特性，廣泛應用于食品、藥品、石油采收、陶瓷、紙張、繪畫、化妝品、抗腫瘤、抗微生物及抗病毒等方面。
目前羅爾阿太菌多糖的研究主要集中在多糖的物理化學特性、分子構象、抗腫瘤活性、免疫活性及藥物緩釋方面，但鮮見通過選育菌種提高產糖量的報道。原生質體融合技術廣泛應用于菌種選育，具有重組頻率高、遺傳物質完善、易獲得性狀優良的融合菌等優點。陳合等利用原生質體融合技術選育出高產靈芝多糖的靈芝菌；靳挺等利用原生質體融合技術選育出高產茁霉多糖的出芽短梗霉。Gunashree等利用原生質體融合技術成功地將黑曲霉和曲霉菌進行了融合。本研究以菌株AY6657741為試驗材料，采用原生質體融合技術選育多糖高產草酸低產的菌株，為提高多糖產量奠定理論基礎。
1材料與方法
1.1試驗材料
羅爾阿太菌菌株AY6657741，由吉林農業大學發酵工程實驗室分離和保藏。經紫外和亞硝基胍復合誘變獲得突變菌株Ar-1和Ar-2.
溶壁酶（≥200 U·mg——1）購自上海楷洋生物技術有限公司；纖維素酶（≥10000 U·mg——1）、蝸牛酶（≥2000 U·mg——1）、KCl、NaCl，聚乙二醇（PEG）6000等試劑均購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司。
PDA斜面培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，121℃滅菌20 min。
種子培養基：葡萄糖20 g，酵母浸粉1.0 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，NaNO33.0 g，KCl 0.5 g，加蒸餾水定容至1 L，pH 4.55，121℃滅菌20 min。
發酵培養基：玉米淀粉35 g，玉米黃漿50 mL，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，NaNO33.1 g，KCl 0.5 g，檸檬酸0.4 g，加蒸餾水定容至1 L，pH 4.55，121℃滅菌20 min。
低滲培養基：蛋白胨5.0 g，瓊脂15 g，牛肉浸膏3.0 g，葡萄糖10 g，酵母浸粉1.0 g，馬鈴薯200 g，蒸餾水定容到1 L，pH 4.55，121℃滅菌20 min。
雙層再生培養基：低滲培養基中加入滲透壓穩定劑（0.4 mol·L——1的KCl、NaCl、蔗糖、MgSO4），上層瓊脂15 g，下層瓊脂5 g，pH 4.55，121℃滅菌20 min。
1.2生長曲線的測定
將A.rolfsii AY6657741菌株接種于250 mL種子培養基中，29℃、200 r·min——1空氣浴振蕩培養72 h，轉接入發酵培養基中，接種量為7%，29℃、200 r·min——1培養162 h.期間每6 h取出3瓶培養基，分別用HCl調節pH至7.0，用蒸餾水稀釋3倍，8000 r·min——1離心15 min。棄上清液留菌絲體，80℃烘干菌絲體至恒質量，稱菌絲體干質量，獲得菌體生長曲線。
1.3菌懸液的制備
取斜面培養菌株，無菌水沖洗，渦旋器振蕩混勻，用無菌擦鏡紙濾去菌絲體片段，用無菌水稀釋至終濃度為1.0×105mL——1，轉接入種子培養基中，29℃、200 r·min——1振蕩培養55 h。
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