紅螯螯蝦源布氏檸檬酸桿菌分離鑒定和耐藥性分析（二）
1.6人工感染斑馬魚試驗(yàn)
試驗(yàn)所用斑馬魚購(gòu)自杭州環(huán)特生物科技股份有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(浙)2022—0003]。試驗(yàn)在廣西民族大學(xué)智能水產(chǎn)養(yǎng)殖室進(jìn)行，在正式試驗(yàn)開始前，先將斑馬魚在1.0 m×0.8 m×0.4 m的養(yǎng)殖水箱中馴養(yǎng)14 d，以適應(yīng)試驗(yàn)飼料和養(yǎng)殖環(huán)境。馴養(yǎng)結(jié)束后，取40尾體長(zhǎng)(3.4±0.2)cm，體質(zhì)量為(0.51±0.1)g的健康斑馬魚，隨機(jī)分為4個(gè)組:1.5×108CFU/mL組、0.75×108CFU/mL組、1.5×107CFU/mL組和陰性對(duì)照組(前3個(gè)組統(tǒng)稱為試驗(yàn)組)，每組10尾。1.5×108CFU/mL組處理方式:將分離菌株的單菌落轉(zhuǎn)接至MH液體培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)12 h，以麥?zhǔn)媳葷岱ㄏ♂屩翝舛葹?.5×108CFU/mL的菌懸液，取1 mL菌懸液用冷凍離心機(jī)于5 000 r/min離心2 min，棄上清，用0.9%生理鹽水洗滌沉淀1～2次，重復(fù)離心操作1～2次，最后加入50μL 0.9%生理鹽水，以50μL的劑量對(duì)斑馬魚進(jìn)行腹腔注射。0.75×108CFU/mL組和1.5×107CFU/mL組參考1.5×108CFU/mL組制備不同濃度的菌懸液，陰性對(duì)照組注射50μL無(wú)菌0.9%生理鹽水，連續(xù)觀察7 d，期間每天觀察記錄斑馬魚的癥狀和死亡情況，并對(duì)死亡的斑馬魚進(jìn)行檢剖以及病原菌的分離和鑒定。
1.7細(xì)菌耐藥性試驗(yàn)
采用K-B紙片擴(kuò)散法檢測(cè)分離菌株對(duì)25種抗菌藥物的敏感性，判定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)，以抑菌圈直接大小作為敏感中介和耐藥的判定標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行3次平行。
2結(jié)果
2.1細(xì)菌的鑒定
菌落形態(tài)觀察:將純化后的分離菌株接種于TCBS瓊脂培養(yǎng)基，單菌落呈現(xiàn)不規(guī)則、不透明、表面有光澤、亮黃色，并呈現(xiàn)向外圍擴(kuò)散的生長(zhǎng)趨勢(shì)(圖1A)。分離菌株革蘭染色為紅色短桿狀(圖1B)，將此株優(yōu)勢(shì)菌命名為171215-10。
圖1分離菌株的菌落形態(tài)(A)和革蘭染色(100×)觀察(B)
生化鑒定:根據(jù)分離菌株171215-10的生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果(表1)，結(jié)合《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和Brenner等的研究，鑒定該菌株為布氏檸檬酸桿菌。
表1分離菌株171215-10的生化鑒定
16S rDNA鑒定:對(duì)分離菌株171215-10的16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，并基于16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，分離株171215-10與布氏檸檬酸桿菌聚為一支(圖2)。
圖2基于16S rDNA序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹
菌株生長(zhǎng)曲線:如圖3所示，分離菌株171215-10在0～5 h處于延滯期，5～16 h處于對(duì)數(shù)快速生長(zhǎng)期，16～30 h處于穩(wěn)定期，30 h后開始進(jìn)入衰亡期。
圖3分離菌株171215-10的生長(zhǎng)曲線
2.2人工感染斑馬魚試驗(yàn)
圖4斑馬魚感染試驗(yàn)結(jié)果
結(jié)果如圖4所示，1.5×108CFU/mL組斑馬魚在注射菌懸液后2 h開始出現(xiàn)死亡，至第2天時(shí)全部死亡，累計(jì)存活率為0%;0.75×108CFU/mL組斑馬魚在注射菌懸液后第5天不再死亡，累計(jì)存活率為30%;1.5×107CFU/mL組斑馬魚在注射菌懸液后第3天不再死亡，累計(jì)存活率為40%;陰性對(duì)照組第2天不再死亡，累計(jì)存活率為90%;分別從陰性對(duì)照組和各試驗(yàn)組死亡的斑馬魚體內(nèi)分離得到菌株，經(jīng)細(xì)菌鑒定，除陰性對(duì)照組外，其余各試驗(yàn)組菌株與注射菌株171215-10一致。
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