不同濃度條件下微藻計數(shù)方法：流式細(xì)胞儀VS血球計數(shù)板計數(shù)
摘要：為了探討流式細(xì)胞儀對不同濃度條件下微藻個數(shù)進(jìn)行計數(shù)的準(zhǔn)確度和精密度，該文應(yīng)用流式細(xì)胞儀和血球計數(shù)板計數(shù)兩種方法，對水體中的赤潮異灣藻數(shù)目進(jìn)行不同濃度梯度的檢測對比分析，可以發(fā)現(xiàn)，流式細(xì)胞儀計數(shù)結(jié)果的RSD值均小于5%，體現(xiàn)了更好的精密度，是一種可以代替血球計數(shù)板計數(shù)的快速準(zhǔn)確的方法。
細(xì)胞計數(shù)是醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域研究中的重要環(huán)節(jié)。其在了解細(xì)胞生長狀態(tài)、密度測定、環(huán)境監(jiān)測等方面具有十分重要的作用和影響。用于檢測單細(xì)胞微藻的方法多采用血球計數(shù)板法，但該方法費(fèi)時費(fèi)力，重現(xiàn)性較差。為了提高檢測效率以及檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，本文嘗試?yán)昧魇郊?xì)胞儀計數(shù)法，選取微型浮游植物赤潮異彎藻，通過用血球計數(shù)板計數(shù)法和流式細(xì)胞儀計數(shù)法對不同濃度梯度的微藻溶液進(jìn)行計算值和實測值的對比分析，驗證流式細(xì)胞儀對微藻計數(shù)的準(zhǔn)確度和精密度。
1材料與方法
1.1試驗材料和儀器
流式細(xì)胞儀染色劑Guava ViaCount（Merck Millipore），血球計數(shù)板（MARIENFELD），流式細(xì)胞儀（Partec CyFlow Cube），光學(xué)顯微鏡（XSP-8CA，上海），圓周振蕩器（Vortex 3，IKA）。
1.2試驗方法
1.2.1血球計數(shù)板計數(shù)法
取1 mL微藻懸液于離心管，加入160?L4%的戊二醛，震蕩搖勻后靜置5 min。試驗中采用25×16格的血球計數(shù)板在顯微鏡下對稀釋后的微藻懸液進(jìn)行計數(shù)。
其計算公式如下：單細(xì)胞微藻數(shù)/mL=80小格內(nèi)微藻個數(shù)/80×400×104×稀釋倍數(shù)。
1.2.2流式細(xì)胞儀計數(shù)法
取適量微藻培養(yǎng)液于離心管中振蕩均勻，從中移取400?L藻液至3.5 mL樣品管，加入適量染色劑振蕩混勻并避光存放30 min，取海水稀釋待測液至1.2 mL，混勻過濾后即可使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行計數(shù)。
其計算公式如下：單細(xì)胞微藻數(shù)/mL=儀器讀出的活體微藻數(shù)/測樣體積×1000×稀釋倍數(shù)。
2結(jié)果與討論
2.1流式細(xì)胞儀的精確度分析
該文采用了傳統(tǒng)的血球計數(shù)板計數(shù)對比流式細(xì)胞儀計數(shù)，每種方法重復(fù)3次，取平均值，兩種計數(shù)方法所得到的平均值非常接近，但是血球計數(shù)板多次計數(shù)所得到的各項數(shù)值偏離平均值的程度較大，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD約為5%，而流式細(xì)胞儀精確度較好，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2%，Eva L.Joachimsthal和Yingying Wang也在研究中提到了流式細(xì)胞儀的標(biāo)準(zhǔn)偏差都小于5%，能得到比較可信的結(jié)果。
2.2流式細(xì)胞儀的準(zhǔn)確度分析
實驗設(shè)置了幾組不同的濃度梯度，對異灣藻進(jìn)行實驗，根據(jù)測出的原始初樣濃度，進(jìn)行相應(yīng)稀釋度的理論計算和流式細(xì)胞儀計數(shù)，如圖1所示，不同稀釋度的計算值和實際測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差大都小于2%，擬合度比較好，說明流式細(xì)胞儀計數(shù)的精確度很高，從圖中也可以看出，在不同稀釋度下的計算值和實際測量值之間的差值也非常小，表明流式細(xì)胞儀計數(shù)的準(zhǔn)確度良好。
3結(jié)語
通過兩種計數(shù)方法的對比分析可以看出，流式細(xì)胞儀計數(shù)具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，解決了傳統(tǒng)方法計數(shù)中活體藻游動和取樣過程帶來的隨機(jī)性問題，計數(shù)過程簡便快捷，更適合實際應(yīng)用。
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