柯薩奇病毒B組4型疫苗候選株篩選與研發
柯薩奇病毒B組4型(Coxsackievirus B4，CVB4)是一種能夠引起腦炎、急性弛緩性麻痹和心肌炎等嚴重疾病的腸道病毒，并且還被認為與Ⅰ型糖尿病密切相關。近年來，國內外CVB4的檢出率不斷升高，已成為一個重要病原體。其致病機理尚不明確，也沒有針對CVB4的抗病毒藥物和疫苗上市。本研究對CVB4代表株的基因型、全基因組序列、一步生長曲線、遺傳穩定性和乳鼠致病性等因素進行初步研究，篩選出一株CVB4的疫苗候選株，并對其免疫原性進行評價，為CVB4的防控提供參考和CVB4的疫苗研發提供實驗數據。
方法
1.對課題組前期分離到的28株CVB4分離株使用Vero細胞進行傳代適應培養。
2.提取CVB4分離株的病毒RNA，并對VP1序列進行測序，根據VP1序列進行基因分型，并對能在Vero細胞上適應的4株CVB4分離株進行全基因組序列分析。
3.對Vero細胞適應株(136、138、140和141)進行蝕斑純化，并將毒株傳代至第五代，使用微量細胞病變法測定滴度，選擇滴度較高的CVB4毒株進行后續實驗。
4.將毒株傳代至第15代，對P1、P5、P10和P15代病毒進行全基因組測序，分析毒株的遺傳穩定性。
5.選擇P5代的毒株，使用CVB4分離株進行乳鼠致病性實驗，選擇3.5、4.5和5.5lgCCID50三個劑量進行乳鼠攻毒實驗，并根據乳鼠的臨床評分、病理變化、免疫組化和病毒載量結果，探究毒株致病性。
6.選擇滴度高且遺傳穩定性較好的140毒株，測定病毒株的一步生長曲線，制備滅活疫苗，使用BALB/c小鼠評估其免疫原性。并檢測血清交叉保護能力和母傳抗體的保護性。
結果
1.本研究分離到的28株CVB4分離株均位于D基因型中，是中國流行基因型。獲得4株在Vero細胞上適應良好的CVB4分離株，4株能在Vero細胞上適應的CVB4分離株的全基因組序列和中國流行株0316的核苷酸和氨基酸同源性為92.83%～93.42%和98.26%～98.53%;和其他中國流行株的核苷酸和氨基酸同源性為80.87%～81.53%和96.52%～97.11%;和其他國外流行株的核苷酸和氨基酸同源性為80.65%～93.38%和95.92%～97.57%。
2.對4株CVB4毒株蝕斑純化后傳代至第5代，測定滴度，140和141毒株的滴度達到7.25lgCCID50/mL，136和138毒株滴度為6.25lgCCID50/mL。
3.140毒株相比于141毒株具有更好的遺傳穩定性，突變位點較少且VP1區段沒有發生突變。
4.140和141毒株均引起腦部、肝臟和肺部嚴重的病理改變，免疫組化結果表明這些組織中有明顯的抗原分布，并且腦部和肝臟的病毒載量高于其他組織，肺部的病毒載量也處在較高水平。5.51gCCID50劑量的141毒株實驗組中小腸、胰腺和心臟出現明顯的病理變化，小腸、胰腺和心臟組織可見抗原分布。
5.一步生長曲線結果顯示，MOI=1時，140毒株病毒拷貝數在3～18小時內快速增加;在18～24小時，病毒拷貝數緩慢增加;在24～30小時出現平臺期。
6.140毒株制備滅活疫苗，20μg組在3免后21天的中和抗體效價達到1:2048，該疫苗誘導的中和抗體對136、138、141和A155毒株具有較好的交叉保護作用，誘導的母傳抗體可以保護乳鼠在致死劑量攻毒下全部存活，未見明顯癥狀。
結論
1.本研究中得到4株Vero細胞上適應較佳的CVB4分離株，4株分離株位于基因型D，是中國大陸流行基因型。
2.CVB4毒株對腦部、肝臟和肺部具有較強的組織嗜性。
3.本研究成功篩選到一株滴度高、遺傳穩定性好且免疫原性較好的CVB4疫苗候選株140毒株。
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