無性型蟲草菌株qsun-1發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分優(yōu)化及生長影響因素
蟲草菌[Cordycepssinensis(Berkey)Sacc.]隸屬于真菌界(Fungi)、子囊菌門(Ascomycota)、子囊菌綱(Ascomycetes)、糞殼菌亞綱(Sordariomycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲草屬(Cordyceps)[1-3]。一般蟲草菌侵染寄主后，菌絲體分化形成墊狀結(jié)構(gòu)即子座。子座膨大并產(chǎn)生子實體，即子囊殼，成熟的子囊殼中產(chǎn)生子囊和子囊孢子。在野外蟲草菌孢子在夏季萌發(fā)侵染土壤中的蝙蝠蛾幼蟲后，形成的子座在次年5月份長出地面[4]，貌似草，這種蝙蝠蛾幼蟲與蟲草菌的復(fù)合體稱為冬蟲夏草。冬蟲夏草主要分布于我國的青藏高原海拔3 500～5 000 m的高山草甸或高山灌叢草甸，在四川、云南和甘肅也有少量分布[5]。作者從野外采集的冬蟲夏草中分離無性型蟲草菌株，對菌蟲體組織和子座組織萌發(fā)、無性型蟲草菌株菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)進行了觀察，同時對無性型蟲草菌株發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分進行了優(yōu)化，以期為人工培育冬蟲夏草以及無性型蟲草菌株發(fā)酵提供理論基礎(chǔ)。
1實驗材料
1.1冬蟲夏草
新鮮冬蟲夏草，采自四川省阿壩藏族羌族自治州黑水縣，冰箱中4℃保存。
1.2培養(yǎng)基
分離培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):馬鈴薯20%，葡萄糖2%，VB10.01%，KH2PO40.1%，MgSO40.1%，瓊脂2%，pH 6.0。用于無性型蟲草菌株的分離。
斜面培養(yǎng)基(1%牛肉粉PDA培養(yǎng)基):馬鈴薯20%，葡萄糖2%，牛肉粉1%，VB10.01%，KH2PO40.1%，MgSO40.1%，瓊脂2%，pH 6.0。用于無性型蟲草菌株的保藏。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基:葡萄糖3%，牛肉粉2%，KH2PO40.1%，MgSO40.1%，VB10.01%，pH 6.0。用于無性型蟲草菌株的發(fā)酵。
2實驗方法
2.1分離
用水清洗冬蟲夏草表面的雜質(zhì)，在無菌條件下分別用0.1%氯化汞、75%酒精對冬蟲夏草進行表面消毒，無菌水沖洗多次[6]，以頭部為界將其剪開，生長子座的頭部稱為子座組織，頭部以外的稱為菌蟲體組織。將子座及菌蟲體組織分別放入分離培養(yǎng)基中，在18℃培養(yǎng)，觀察，重復(fù)3次，統(tǒng)計萌發(fā)情況，并且挑取萌發(fā)的菌絲體進一步分離純化后接入斜面培養(yǎng)基保藏。
2.2生長觀察
將分離的無性型蟲草菌株qsun-1分別接入PDA及1%牛肉粉PDA平板中，18℃培養(yǎng)，觀察生長情況。同時將接有無性型蟲草菌株qsun-1的PDA培養(yǎng)基放在15、18、25、32℃培養(yǎng)，觀察生長情況。以菌落直徑作為衡量生長情況的指標，每隔5 d測量1次。
2.3顯微結(jié)構(gòu)觀察
無菌操作，用接種棒從液體培養(yǎng)基中挑取菌絲，放在滴有純化水的載玻片上，輕輕將菌絲展開，不染色直接用顯微鏡進行觀察[7]。
2.4發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化
將無性型蟲草菌株qsun-1在1%牛肉粉PDA液體培養(yǎng)基中活化3 d，以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵條件:裝液量每250 mL裝100 mL，溫度18℃，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，時間5 d。發(fā)酵結(jié)束后3 000 r/min離心10 min分離菌絲體，烘干稱重。
以葡萄糖、果糖、蔗糖、可溶性淀粉及甘露醇為碳源，確定最佳碳源。確定蔗糖為最佳碳源后，分別考察1%、2%、3%、4%、5%蔗糖對無性型蟲草菌株qsun-1菌體生長的影響，確定最佳蔗糖質(zhì)量分數(shù)。以牛肉粉、蛋白胨、NaNO3、(NH4)2SO4及尿素為氮源，確定最佳氮源。確定蛋白胨為最佳氮源后，分別考察0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%蛋白胨對無性型蟲草菌株qsun-1菌體生長的影響，確定最佳蛋白胨質(zhì)量分數(shù)。上述條件確定后依次考察0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%MgSO4和KH2PO4對無性型蟲草菌株qsun-1菌體生長的影響，確定最佳的MgSO4、KH2PO4的質(zhì)量分數(shù)[8-10]。
3結(jié)果與分析
3.1萌發(fā)和分離
對新鮮冬蟲夏草不同部位進行分離，得到無性型蟲草菌株qsun-1。冬蟲夏草子座組織的菌體萌發(fā)率為60%，而菌蟲體組織的菌體萌發(fā)率僅達到14%，可見子座組織菌絲體容易萌發(fā)，而菌蟲體組織可能由于易受雜菌污染而使萌發(fā)受阻。因此，作者從冬蟲夏草子座中培養(yǎng)并分離了無性型蟲草菌株。
3.2生長特點
3.2.1菌落形態(tài)
無性型蟲草菌株qsun-1在PDA和1%牛肉粉PDA平板中生長10 d后菌落形態(tài)有所不同(圖1)。在PDA培養(yǎng)基中菌落稍微隆起，中心凹陷并有少量水珠，灰白色，菌絲較短，菌落周圍有一透明圈[圖1(a)]，菌落背面暗黃色[圖1(b)]，菌落直徑21 mm。在1%牛肉粉PDA培養(yǎng)基中菌落明顯隆起，純白色，菌絲粗壯[圖1(c)]，菌落背面淡黃色[圖1(d)]，菌落直徑30 mm。
圖1菌株qsun-1菌落形態(tài)
3.2.2菌落生長情況
無性型蟲草菌株屬于嗜低溫菌株，對溫度變化反應(yīng)顯著。在不同溫度下培養(yǎng)的無性型菌株qsun-1生長狀況也不同。無性型蟲草菌株qsun-1在15～18℃生長良好，在25℃生長受到抑制，在32℃條件下未發(fā)現(xiàn)菌株生長。
3.3顯微結(jié)構(gòu)
對無性型蟲草菌株qsun-1液體培養(yǎng)物進行顯微觀察，從顯微結(jié)構(gòu)可以看到液體培養(yǎng)的菌絲主要為管狀菌絲，菌絲有較明顯的分隔，粗細均勻，每節(jié)菌絲均透明。
3.4發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化
3.4.1碳源對qsun-1生長的影響
無性型蟲草菌株qsun-1可以利用多種碳源。當蔗糖為碳源時生長最好，菌體產(chǎn)量達到8.0 g/L，其次是果糖、甘露醇、淀粉和葡萄糖。
3.4.2蔗糖質(zhì)量分數(shù)對qsun-1生長的影響
無性型蟲草菌株qsun-1在蔗糖為1%時生長較慢；在蔗糖質(zhì)量分數(shù)達到2%時，生長量最大；當蔗糖質(zhì)量分數(shù)超過2%時，菌體生長受到一定程度的抑制；當蔗糖質(zhì)量分數(shù)達到5%時，菌體生長明顯受阻(圖2)。
圖2蔗糖質(zhì)量分數(shù)對菌株qsun-1生長的影響
3.4.3氮源對qsun-1生長的影響
無性型蟲草菌株qsun-1可利用多種氮源。當以蛋白胨為氮源時生長最好，菌體產(chǎn)量達到8.1 g/L，其次為NaNO3、牛肉粉、(NH4)2SO4。以尿素為氮源時，未見無性型蟲草菌株qsun-1生長。
3.4.4蛋白胨質(zhì)量分數(shù)對qsun-1生長的影響
無性型蟲草菌株qsun-1在蛋白胨為0.5%時，生長緩慢;隨著蛋白胨質(zhì)量分數(shù)的增加生長量逐漸增加，在蛋白胨質(zhì)量分數(shù)達到2%時，菌體生長達到最大值;蛋白胨質(zhì)量分數(shù)超過2%后，菌體生長受到抑制。
3.4.5 MgSO4質(zhì)量分數(shù)對qsun-1生長的影響
無性型蟲草菌株qsun-1在MgSO4為0.05%時生長較慢，在MgSO4達到0.1%時生長量達最大;MgSO4超過0.1%后生長受到一定程度的抑制，并隨著MgSO4濃度的增加而抑制程度增加。
3.4.6 KH2PO4質(zhì)量分數(shù)對qsun-1生長的影響
無性型蟲草菌株qsun-1在KH2PO4為0.05%時生長較慢，隨著KH2PO4濃度的增加生長量逐漸增加，在0.2%左右時達到最大值，在超過0.2%后菌體生長受到抑制。
4結(jié)論
冬蟲夏草子座組織菌絲體容易萌發(fā)，而菌蟲體組織中可能由于易受雜菌污染菌絲體萌發(fā)受阻。作者從冬蟲夏草子座中培養(yǎng)并分離出無性型蟲草菌株qsun-1。通過在PDA和1%牛肉粉PDA中培養(yǎng)無性型蟲草菌株qsun-1，發(fā)現(xiàn)1%牛肉粉PDA更適于qsun-1生長，qsun-1在1%牛肉粉PDA培養(yǎng)10 d，菌落明顯隆起，純白色，菌絲粗壯，菌落背面淡黃色，菌落直徑30 mm。觀察qsun-1的顯微結(jié)構(gòu)，可以看到液體培養(yǎng)的菌絲主要為管狀菌絲，菌絲有較明顯的分隔，粗細均勻，每節(jié)菌絲均透明。通過在不同溫度下培養(yǎng)菌株qsun-1，發(fā)現(xiàn)其生長溫度范圍在15～18℃。無性型蟲草菌株qsun-1最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:蔗糖2%，蛋白胨2%，MgSO40.1%，KH2PO40.2%。
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