MDCK單克隆細(xì)胞復(fù)蘇活率、生長狀態(tài)、生長速度和生長形態(tài)研究
MDCK細(xì)胞(犬腎細(xì)胞，Madin-Darby canine kidney cells，MDCK)系是1958年由Madin等從美國的一頭Cocker Spanie母曲架犬的腎臟組織中分離得到的[1]。MDCK細(xì)胞呈上皮細(xì)胞樣，容易培養(yǎng)、增殖快、貼壁生長，也可馴化為懸浮培養(yǎng)，可連續(xù)傳代[2].大量研究表明，MDCK細(xì)胞對多種不同亞型的流感病毒株敏感.病毒用MDCK細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)量高等特點(diǎn)，可以用來代替雞胚用于疫苗的生產(chǎn)[3-6]。MDCK單克隆細(xì)胞是本實驗室由MDCK工作庫細(xì)胞通過有限稀釋法所制備，共制備114株.不同的MDCK單克隆細(xì)胞株在生長特性上有較大的差異.
本研究前期通過有限稀釋法將MDCK細(xì)胞進(jìn)行單克隆化，獲得了自建MDCK單克隆細(xì)胞庫，庫內(nèi)共有114株單克隆細(xì)胞.現(xiàn)通過復(fù)蘇MDCK單克隆細(xì)胞，統(tǒng)計細(xì)胞復(fù)蘇活率、生長狀態(tài)、生長速度和生長形態(tài)等特性，確定MDCK單克隆細(xì)胞庫的可用性，旨在為后期篩選病毒敏感的MDCK單克隆細(xì)胞實驗提供資源和理論參考，為流感疫苗的生產(chǎn)提供參考.
1材料和方法
1.1 MDCK單克隆細(xì)胞
MDCK單克隆細(xì)胞由本實驗利用MDCK工作庫細(xì)胞(MDCK-W-63)通過有限稀釋法篩選獲得，共114株.
1.2主要試劑
DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶和PBS(蘭州百靈生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清(蘭州民海生物有限公司)；臺盼藍(lán)(廣州展晨生物科技有限公司).
1.3主要儀器設(shè)備
CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊公司)、生物倒置顯微鏡(日本奧林巴斯光學(xué)科技有限公司)、潔凈操作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司).
1.4細(xì)胞培養(yǎng)
將儲存于液氮罐中的MDCK單克隆細(xì)胞取出，在37℃水中快速融化后置于50 cm2培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清)，再置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).待MDCK細(xì)胞生長至致密單層時，PBS液清洗，倒出PBS后加入5 mL 0.25%胰酶，緩慢搖動細(xì)胞培養(yǎng)瓶，使胰酶充分沒過細(xì)胞表面，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)消化5 min取出，在顯微鏡下觀察.當(dāng)細(xì)胞全部變圓并開始脫落時棄去胰酶，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)放置3 min后取出，并倒去胰酶加入15 mL DMEM培養(yǎng)基.將細(xì)胞吹打混勻后按1∶4比例傳代，將細(xì)胞繼續(xù)放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).
1.5細(xì)胞復(fù)蘇活率
待細(xì)胞復(fù)蘇后，將細(xì)胞懸液50 uL加入PE管中，加入50uL 0.5%臺盼藍(lán)染液，染色2～3 min.吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片，鏡下取任意視野細(xì)胞計數(shù).死細(xì)胞能被臺盼藍(lán)染上色，鏡下可見深藍(lán)色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無色透明狀.細(xì)胞活率=(未著色細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞)×100%.
1.6細(xì)胞生長速度、狀態(tài)
如1.4中所述進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇并培養(yǎng)至單層致密，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×104個/mL傳代細(xì)胞.將細(xì)胞置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞兩次.統(tǒng)計MDCK單克隆細(xì)胞長滿需要的時間，以評價細(xì)胞生長速度.通過觀察細(xì)胞的邊緣清晰程度、整齊程度與大小差異來評價細(xì)胞生長狀態(tài).
1.7細(xì)胞的生長形態(tài)
如1.4中所述復(fù)蘇細(xì)胞，將細(xì)胞置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞兩次.觀察細(xì)胞復(fù)蘇貼壁后細(xì)胞的生長形態(tài)并統(tǒng)計細(xì)胞生長形態(tài)的種類.
2結(jié)果
2.1 MDCK單克隆細(xì)胞的復(fù)蘇活率
MDCK單克隆細(xì)胞庫內(nèi)114株MDCK單克隆細(xì)胞株復(fù)蘇后，細(xì)胞最低活率為92.1%，最高活率為97.3%，平均活力為0.954±0.016，高于制備MDCK單克隆細(xì)胞所使用的工作庫細(xì)胞.
2.2 MDCK單克隆細(xì)胞的生長狀態(tài)和速度
MDCK單克隆細(xì)胞庫內(nèi)114株細(xì)胞，2 d長滿的細(xì)胞株為70株，占61.4%；3 d長滿的35株，占30.7%；4 d長滿5株，占4.4%；超過4 d長滿的4株，占3.5%.細(xì)胞生長狀態(tài)良好的細(xì)胞有66株，占57.9%,一般的細(xì)胞有43株，占37.7%；較差的細(xì)胞共有5株，占4.4%.
表1 MDCK單克隆細(xì)胞生長速度和狀態(tài)統(tǒng)計表
2.3 MDCK單克隆細(xì)胞形態(tài)分析
MDCK單克隆細(xì)胞共有3種細(xì)胞形態(tài)，第一類為典型的多角上皮樣細(xì)胞形態(tài)，與MDCK母細(xì)胞形態(tài)一致，長滿單層后呈規(guī)則石塊狀鋪展生長，貼壁迅速.高倍鏡下細(xì)胞胞質(zhì)豐滿，核仁清晰，如圖1A所示.第二類為梭形成纖維狀細(xì)胞形態(tài)，與MDCK母細(xì)胞的形態(tài)差異較大，細(xì)胞呈梭形、長條形、不規(guī)則形，呈相互平行排列，細(xì)胞呈現(xiàn)成群放射狀、漩渦狀等形態(tài)，長滿匯合至100%時細(xì)胞呈細(xì)枝狀交錯生長，如圖1B所示.第三類為島狀樣細(xì)胞生長形態(tài)，與MDCK母細(xì)胞形態(tài)的差異更大.細(xì)胞單個貼壁，相互分散生長，一般不連成片、形成集落.相鄰單個細(xì)胞生長擁擠，細(xì)胞形成島狀樣生長，如圖1C所示.114株MDCK單克隆細(xì)胞的具體形態(tài)分布見表2，MDCK單克隆細(xì)胞中多角上皮樣細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞有78株，占68%；成纖維樣細(xì)胞有13株，占12%；島狀樣細(xì)胞有23株，占20%.
表2 MDCK單克隆細(xì)胞形態(tài)表
A.多角上皮樣細(xì)胞(×100)；B.梭形成纖維樣細(xì)胞(×100)；C.島狀樣細(xì)胞(×100)
3討論
流感對人類健康威脅嚴(yán)重，及時接種疫苗是預(yù)防流感最有效的方法[7].目前，獲準(zhǔn)生產(chǎn)人用流感疫苗的細(xì)胞系主要有Vero細(xì)胞和MDCK細(xì)胞[8].近年來使用MDCK單克隆細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗獲得很大發(fā)展[9].有限稀釋法是制備MDCK單克隆細(xì)胞經(jīng)濟(jì)有效的方法，其通過細(xì)胞稀釋至每孔只有單個細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)而獲得單克隆化細(xì)胞株，所制備的MDCK單克隆細(xì)胞株在生長特性上有較大差異.基于此，通過復(fù)蘇MDCK單克隆細(xì)胞株，統(tǒng)計所有細(xì)胞的生長速度、生長狀態(tài)以及細(xì)胞形態(tài)類型及其數(shù)量，確定制備的MDCK單克隆細(xì)胞庫的可用性.
MDCK細(xì)胞作為生產(chǎn)流感疫苗的基質(zhì)，其培養(yǎng)好壞直接影響著流感病毒的篩選[10].細(xì)胞生長好壞可通過細(xì)胞的活率、生長狀態(tài)、生長速度、生長形態(tài)來綜合評價，活率高、狀態(tài)好、速度快、形態(tài)均一的細(xì)胞更適用于科學(xué)研究.細(xì)胞復(fù)蘇后經(jīng)過培養(yǎng)可以修復(fù)損傷的細(xì)胞膜功能[11]，細(xì)胞活率在復(fù)蘇培養(yǎng)過程中可以得到顯著提高.本實驗室自建MDCK單克隆細(xì)胞庫細(xì)胞平均復(fù)蘇活率達(dá)0.954±0.016%，與細(xì)胞凍存前后活率差異不大，但比MDCK母細(xì)胞活率高.細(xì)胞的生長速度是提高實驗效率的重要條件，實驗周期是研究人員要密切關(guān)注的問題.生長速度的提高可以縮短實驗周期，篩選生長速度快的細(xì)胞就顯得尤為重要.MDCK單克隆細(xì)胞庫中大多數(shù)細(xì)胞均可在2～3 d長滿，有利于實驗快速有效地開展，縮短了實驗周期.細(xì)胞的生長狀態(tài)也是影響實驗成功與否的重要因素，生長狀態(tài)好的細(xì)胞更加有利于得到理想的實驗結(jié)果，MDCK單克隆細(xì)胞庫中生長狀態(tài)良好的細(xì)胞占比為57.9%，可為實驗提供可靠的細(xì)胞資源.細(xì)胞形態(tài)的多樣性可以用來評價MDCK單克隆細(xì)胞庫細(xì)胞的豐富性.本研究中MDCK單克隆細(xì)胞具有三種細(xì)胞形態(tài).
前期實驗自制的MDCK單克隆細(xì)胞庫內(nèi)細(xì)胞復(fù)蘇活率高，生長速度快，狀態(tài)良好，庫內(nèi)細(xì)胞有三種形態(tài)，可為后續(xù)甲型H1N1流感病毒篩選實驗提供敏感細(xì)胞基質(zhì)，為篩選提供豐富的資源，并為流感疫苗的生產(chǎn)參考依據(jù).
相關(guān)新聞推薦
1、不同濃度的表面活性劑PEG6000、SDS脅迫培養(yǎng)對細(xì)菌生長的影響【下】
2、嗜熱脂肪地芽孢桿菌生長曲線預(yù)測模型應(yīng)用于預(yù)測煉乳腐敗變質(zhì)