HMO高利用率菌株篩選方法及生長曲線繪制
人乳中的低聚糖(HMO)作為一種重要的益生元，對嬰兒的健康有著獨特的作用。2’-鹽藻基乳糖(2’-FL)和乳糖-N-新四糖(LNnT)作為兩種豐富的HMO，由于其對嬰幼兒的獨特益處和巨大的商業價值而越來越受到人們的關注。它們對嬰兒具有優越的益生元特性，其他健康影響也得到了證實，包括免疫調節、抗炎、預防壞死性小腸結腸炎、抗粘附抗菌劑、抗病毒活性和促進腸上皮細胞成熟。安全性評估和臨床試驗表明，2’-FL和LNnT對嬰兒是安全和耐受性良好的，已經在商業上作為嬰兒配方奶粉的功能性成分添加。
嬰兒的腸道微生物群通常富含雙歧桿菌屬，在不同的腸道微生物中，嬰兒腸道相關雙歧桿菌可以有效同化HMO。研究表明，HMO同化能力在不同的雙歧桿菌種類和菌株之間有顯著差異。因此，要真正最大限度地發揮益生元和益生菌補充劑在商品化配方中的作用，需要更詳細地了解益生菌的HMO同化行為。
應用Biosense全自動生長曲線分析儀監測HMO利用菌株的生長過程，篩選的長雙歧桿菌嬰兒亞種dipro-F，dipro-15和dipro-105能夠高效利用HMO。
1)分別將待測多株雙歧桿菌活化得到種子液，然后將種子液離心后PBS洗滌重懸后得到細菌懸液，然后將細菌懸液1％-10％的體積百分比加入到含有溴酚甲紫的無碳源MRS+培養基中培養，以2’-FL和LNnT分別作為唯一碳源進行添加，然后以葡萄糖為陽性對照，以水為陰性對照，觀察培養基顏色，菌株生長，則培養基顏色變黃，反之培養基顏色維持紫色，將獲得的培養基顏色變黃對應的菌株初步判斷為能夠同時利用2’-FL和LNnT的菌株；
圖為8株菌在三種碳源下的生長曲線；
圖葡萄糖為碳源時，三株HMO利用菌株的生長曲線；
圖以2’-FL為碳源時，三株HMO利用菌株的生長曲線；
圖以LNnt為碳源時，三株HMO利用菌株的生長曲線。
2)使用步驟
得到的菌株分別制備細菌懸液，將細菌懸液接種到含有無碳源MRS+培養基中，以2’-FL和LNnT分別作為唯一碳源進行添加，然后以葡萄糖為陽性對照，以水為陰性對照，根據取樣時間次數，配置多個平行培養的菌，每隔幾個小時測定OD600，繪制生長曲線，根據生長曲線計算曲線下面積AUC，根據AUC判斷測試的不同菌株對不同碳源的利用率；AUC的公式如下：
其中，t為時間，0＜i＜48h，OD代表OD600值，當測試的菌株的AUC值大于標準菌株(M16V菌株)的10倍以上，即為HMO高利用率菌株。
其中，雙歧桿菌包含短雙歧桿菌、長雙歧桿菌嬰兒亞種、兩歧雙歧桿菌、假小鏈雙歧桿菌、短雙歧桿菌和動物雙歧桿菌中的一種或多種。
其中，步驟1)無碳源MRS+培養基是在無碳源MRS培養基的基礎上添加終濃度為0.5g/L半胱氨酸。
其中，無碳源MRS培養基包括如下組成：蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉膏10.0g、無水乙酸鈉5.0g、無水磷酸氫二鉀2.0g、檸檬酸氫二銨2.0g、七水硫酸鎂0.58g、四水硫酸錳0.25g、吐溫-80 0.1mL，加蒸餾水至1000mL，調整pH值至6.2～6.4，121℃滅菌15分鐘。
其中，步驟1)和步驟2)中的葡萄糖、2’-FL和LNnT工作濃度均為2-20g/L。作為優選，工作濃度為10g/L。
其中，步驟1)中的細菌懸液的濃度為OD600＝0.5-5。
其中，步驟2)細菌懸液的濃度為OD600＝0.5-5。
基于上述篩選方法得到的高HMO利用率菌株。
結論：這種HMO高利用率菌株的高通量篩選方法，簡單快捷，篩選一目了然，可以用于HMO為唯一碳源的利用率篩選，也可以用于其他碳源作為唯一碳源的利用率篩選；這種HMO利用率定量篩選的方法，避免了厭氧菌在生長曲線測定過程中反復取放引起氧氣后對菌株生長造成的影響，為嚴格厭氧菌的生長曲線測定提供了一種可行的實驗方案。篩選的長雙歧桿菌嬰兒亞種dipro-F，dipro-15和dipro-105能夠高效利用HMO，相比市場所售的嬰幼兒可食用名單菌株具有更優的HMO利用效率，經過全基因組測序確定了HMO利用機制，菌株經實驗驗證不存在安全隱患。
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